使用 Ever 设计自动化、高通量、连续细胞生长实验

1. 准备媒体、瓶和伊诺库鲁姆 请注意:此协议假定用户已经校准了 eVOLVER 系统, 并且正在使用之前工作16中描述的智能套筒配置。智能套筒易于重新设计或修改, 但对于替代配置, 音量和控制参数的设置详细信息可能会有所不同。 实验前一天, 在30°c 的模拟物质培养基 (酵母 Pepone Dextrose) 中, 在设置为至少 300 R.P.M 的晃动孵化器中制备2 毫升夜间液体培养的酿酒酵母 by4741 参考菌株和变异菌株。 将无菌 YPD 介质转移到装有管材的清洁高压灭菌瓶中。此外, 介质也可以直接在装有油管的瓶子中高压灭菌。请注意:瓶子与油管配合使用, 方法是在瓶盖上钻一个洞, 并通过它的连接器运行油管, 以确保其固定到位。请参阅材料表。 在每个小瓶上加入搅拌杆, 并在装有流入和流出的小瓶盖上拧紧。通过目视检查确保所有组件清洁。 将小瓶放在可高压灭菌的机架中, 用铝箔覆盖, 并在重力或真空循环上进行20分钟的灭菌步骤。 2. 设置实验 在三个大型烧杯中, 制备500毫升的10% 漂白剂, 200 毫升的10% 漂白剂, 300 毫升的乙醇。 使用 eVOLVER 设备上的开关, 打开 Ever 上的 5 V 电源, 等待 5秒, 然后打开 12 V 电源。 如果从同一介质瓶中运行多个小瓶, 请将多个介质输入线与管道拆分器连接。定制的管材拆分器可以用 Luer 组件制造。 将第一漂白剂烧杯中的介质输入线和第二漂白剂烧杯中的介质排流线淹没。将介质输入线的下游端放置在带有排流线的第二烧杯中。把废线放进垃圾车里。 在大型空废物卡眼中加入1-2 升漂白剂, 对实验过程中产生的废物进行消毒。咨询安全协调员, 以确保废物的妥善处理。 使用赢车上的触摸屏, 导航到设置部分, 并运行所有泵 20秒, 以填充流体线与10% 的漂白剂。在运行过程中, 通过目视检查确保所有线路都已灌装, 泵正常运行。让漂白剂在生产线上静坐至少30分钟进行消毒。 再次运行泵使用触摸屏应用程序, 直到线路不再被淹没, 推动空气通过线路, 以获得尽可能多的漂白剂。 将介质输入线放入乙醇烧杯中, 并按上述方式重复, 在生产线上灌满乙醇并冲洗空气。请注意:由于乙醇很快就会死亡, 因此没有必要等待 3 0分钟的消毒。 使用 Luer 连接器将介质输入线连接到介质瓶, 并运行泵, 直到介质完全通过这些生产线, 冲洗出任何残留的乙醇。 根据线条上的颜色编码, 将灭菌瓶部分插入 eVOLVER 智能套筒中, 并将线条连接到适当的位置。首先将输入线连接到短流入秸秆上, 然后将管道浪费在长的流出秸秆上。注意事项:检查线路是否松动或路由不正确是至关重要的。如果不这样做, 将导致溢出, 并可能损坏智能套筒。 以10秒为增量运行所有泵, 以填充介质的小瓶。通过目视检查, 确保泵通过排流吸管有效去除介质, 防止溢出。如果流出物吸管似乎不能正常工作, 请检查流体线路连接和蠕动泵。根据需要更正或更换零件。 将小瓶向下推, 直到完全被智能套筒包裹。 使用交互式设置页上的 eVOLVER 触摸屏设置实验参数的初始条件。对于所有小瓶, 将温度设置为 30°c, 搅拌设置为10。这可以通过在触摸屏上拖动手指来选择所有小瓶, 从而一次完成所有小瓶。 3. 配置 eVOLVER 软件和编程算法文化例程 在计算机上的 eVOLVER 仪表板中, 导航到实验管理器页。在实验导航面板或现有实验中选择基本实验作为起点, 然后单击 “克隆新”。请注意:通过将 GitHub 链接粘贴到将实验定义保存到实验管理器中的存储库, 可以使用其他组的实验。 指定将在其上运行实验的实验名称和 eVOLVER 设备。通过修改页面上的这些字段, 确保已选择所需的校准设置。 使用小瓶选择器和参数定义窗格设置实验条件。例如, 若要设置小瓶0-4 至30°c 的温度, 请在小瓶选择器中选择小瓶, 将参数定义设置为 30, 然后单击 “设置”。对 OD 重复此操作, 为每个小瓶设置上限和下限。 实验参数定义完成后, 通过单击”保存”并单击”开始”运行来保存实验。 4. 实时启动实验和监控 实验开始后, 导航到交互式仪表板中的实时数据面板。对于每个小瓶, 检查 OD 值是否保持在零, 并且通过浏览图表, 温度是否达到或达到编程水平。 为了准备接种, 测量隔夜培养物的 OD, 计算所需的折叠稀释假设小瓶体积为25毫升, 并通过取样口计算接种到小瓶中的移液器体积。例如, 要达到所需的起始 od 约0.05 在培养小瓶从隔夜培养在 OD 2.0, 625μl 的细胞应添加到每个小瓶。 检查仪表板上的图形, 以查看 OD 图形是否已相应更新。应在图表中看到增加到接近所需的起始 OD。 通过浏览仪表板中的相应图形, 在整个实验过程中跟踪不同的数据类型 (如 OD、温度、增长率、世代和媒体消耗)。这些值可能会通知用户的实验决策 (例如计划时间点), 甚至可以在函数中用于执行自动反馈。 要在实验中期更换介质瓶, 请在实验管理器面板中暂停实验, 以防止泵事件的发生。快速拧开空瓶中的介质线, 并将其连接到新瓶子。避免接触管材的两端, 以防止污染。在实验管理器中继续实验。 5. 从 Ever 瓶中取样酵母细胞 制备环己酰亚胺溶液, 以抑制蛋白质合成, 并固定酵母细胞流式细胞仪分析。在15毫升锥形管中, 加入12毫升的 PBS 和12μl 的 20 Mgml 环己酰亚胺和涡液, 为5秒。 使用多通道移液器, 在96孔圆形底板的每口井中加入100Μl。 用铝箔包裹板材, 以阻挡光线, 并保持在 4°c, 直到需要。 要进行取样, 使用延长的长度200μl 吸头, 通过小瓶盖上的采样端口进行移液器。 移液器100μl 从小瓶进入固定板的井中, 通过上下移液混合2-3 倍, 然后在铝箔中恢复并将钢板恢复到4°c。 6. 实验分解和清理 在大型烧杯中准备1升10% 漂白剂和两升500毫升 di 水溶液。 通过在实验管理器面板中发送停止命令来停止实验。数据仍存储在启用云的数据库中, 以后仍可在仪表板的实时数据面板中查看, 或下载以进行脱机分析。 从智能套筒中取出小瓶, 并将其放置在高压灭菌器机架中, 以避免在后续步骤中溢出。 拧下介质瓶中的介质输入线, 并将其放入10% 漂白剂的烧杯中。从 eVOLVER 用户界面运行泵, 如在设置中消毒线路和小瓶。 断开 DI 水中的小瓶和淹没线的连接。运行泵, 先用 DI 水冲洗系统中的所有漂白剂, 然后用空气冲洗所有漂白剂。 先关闭 12 V 电源, 等待 5秒, 然后关闭 5 V 电源, 以关闭 epolver。 将搅拌棒和瓶盖浸泡在10% 的漂白剂中, 然后用 DI 水冲洗。一定要冲洗流入和流出的秸秆的每个帽运行 di 水通过他们。如果在墙上形成了薄膜, 则使用试管刷擦洗小瓶。 适当处理废物, 彻底冲洗废物容器。注意事项:废物容器中含有10% 漂白剂、灭菌细胞培养废物和微量乙醇的混合物。请咨询安全协调员, 以进行正确的处理和处置。 7. 利用流式细胞仪对分数种群进行量化适宜性分析 使用配备适当荧光通道和探测器的流式细胞仪分析第5节收集的样本16。 每个样本获取至少 10, 000个事件, 并使用正向和侧面散射数据为完整的单元格进行门。 门基于适当的荧光通道 (如 GFP), 以确定每个群体的分数分布。 在计算机上, 单击 “导出” 按钮, 将数据从 “实验管理器” 页保存到所需位置。 从 Revover 数据文件中, 确定每个小瓶的每个时间点完成的世代数。在 Evover 代码中, 通过首先对每个稀释事件之间的 OD 数据进行分段来计算各代, 然后每个段与窗体的基本指数相匹配, 以生成 r, 增长率16。然后使用以下公式计算时间段内的代数: 绘制流式细胞术数据中标记和未标记群体的对数比与采集样本时上述计算的生成数。根据下面的公式确定线性区域并拟合斜率。这个坡度通常被定义为竞技健身 18,19。