코카나발린A에 의해 유도된 수성 결핍 안구 건조증의 토끼 모델: 약물 효능 연구에 적용

모든 동물 연구는 스토니 브룩 대학의 기관 검토 위원회에 의해 승인되었고 안과 및 시력 연구에서 동물 사용에 대한 ARVO 성명서에 따라 수행되었습니다. 1. 동물 및 주택 2-3kg의 뉴질랜드 화이트(NZW) 토끼를 획득합니다. 토끼를 엄격한 온도 (65 ± 5 ° F)와 습도 (45 ± 5 %)의 케이지에 단수로 보관하십시오. 컨트롤. 조명은 12시간 온/오프 사이클이 있어야 합니다. 물과 표준 토끼 차우에 무제한 액세스를 제공합니다. 눈에 영향을 미치는 비타민 A를 함유할 수 있기 때문에 식이 농축을 제거하십시오. 안구 건조의 기준선 측정 또는 유도 전에 적어도 2 주 동안 동물을 적응. 2. 마취 및 안락사의 방법 참고 : 모든 절차는 적당한 축출을 필요로 하는 Con A 주입을 제외하고 온화한 과실을 요구합니다. 온화한 용 적 재 도에 대 한, 주입 acepromazine (1 mg/kg) 피하 26 게이지 바늘을 사용 하 여 어깨에. 온화한 침착을 위한 종점: 동물은 귀 엽이 더 이상 완전히 똑바로 서 있지 않은 편안한 머리 위치를 유지합니다.참고: 적절한 엔드포인트에 도달하지 못하면 아세프로마진을 추가로 주입할 수 있습니다. 동물은 항상 깨어 있어야하며 수염을 만지는 데 반응해야하며 호흡이 느려지는 것을 절대로 보여주지 않아야합니다. 적당한 속식을 위해, 먼저 위와 같이 동물 에게 아세프로마진을 준다. 엔드포인트에 도달한 후(위 참고 참조),O2 유량이 1L/min으로 설정된 방독면을 사용하여 이소플루란을 주고 이소플루란 전달을 5%로 설정하였다(그림2). 토끼의 몸톤이 완전히 완화되고 귀가 완전히 부풀어 오릅니다 때까지 이소플루란을 관리하십시오.참고: 동물의 옆구리를 돌때 보상근육 운동이 발생하지 않아야 합니다. 호흡은 항상 자발적으로 유지됩니다. 자발적인 회복은 2-5 분 이내에 발생합니다 : 징후는 자발적인 머리 움직임과 증가 또는 정상적인 근육 톤을 포함합니다. 적당한 용신으로 실험 절차가 완료 된 후 약 30 분 동안 또는 행동이 정상으로 돌아올 때까지 토끼를 관찰하십시오.참고: 안과 연고는 어느 형태의 침전물 동안에는 필요하지 않습니다. 1) 온화한 과식에서, 동물은 여전히 경고하고 깜박반사를 유지합니다. 적당한 침신에서, 깜박임 반사의 억제는 안구 표면이 위험하지 않다는 것을 너무 짧습니다. 2) 안구 표면에 안과 연고를 배치하면 테스트 중에 평가 된 구조의 시각화가 금지됩니다. 안락사: 정맥 내 펜토바르비탈(100 mg/kg)을 과다 복용하십시오. 3. 틈새 막의 제거 각막의 완전하고 정확한 평가를 허용하기 위해 적응 기간 (일반적으로 첫 주) 동안 제거를 수행합니다. 오른쪽 틈새 멤브레인에 주입참고 : 두 눈의 틈새 멤브레인을 제거하려면 한 세션에서이 작업을 수행하는 것이 가장 간단합니다. 한쪽 눈으로 시작하여 설명된 대로 진행합니다. 설명의 명확성을 위해 이 메서드는 오른쪽 눈으로 시작합니다. 토끼를 적절한 크기의 제지 백에 넣습니다. 단계 2.1에 기재된 바와 같이 온화한 신분 유도. 마이크로파이펫을 사용하여 오른쪽 눈에 방부제가 없는 리도카인 25 μL을 바르습니다. 눈꺼풀 사이에 유연한 와이어 뚜껑 스페큘럼을 놓습니다. 0.3 포셉 (또는 이에 상응하는)을 사용하여 정점에 있는 틈새 멤브레인을 잡고 각막 위로 확장하십시오. 리도카인 1%를 1:100,000 에피네프린으로 26게이지 날카로운 바늘을 사용하여 틈새 멤브레인의 기저부로 주입합니다(그림3A). 적당한 bleb는 틈새 막 위에 형성되어야 합니다. 스펙큘럼을 제거합니다. 왼쪽 틈새 멤브레인에 동일한 주입을 수행하십시오. 틈새 멤브레인 절단 약 5분 후 뚜껑을 다시 오른쪽 눈에 놓습니다. 0.3 포셉(또는 이와 유사한)을 사용하여 정점에 있는 틈새 멤브레인을 잡고 철회합니다. Westcott 가위 또는 이에 상응하는 것을 사용하여 기지에서 틈새 멤브레인을 잘라냅니다(그림 3B).참고: 출혈은 최소한이며 일반적으로 소작이 필요하지 않습니다. 그럼에도 불구하고, 고온 배터리 소작은 추가 적인 지혈이 필요한 경우에 항상 근처에 보관됩니다. 스펙큘럼을 제거합니다. 국소 항생제 연고를 눈에 놓습니다 (예 : 네오마이신, 폴리마이신, 바시트라신 및 하이드로 코르티손). 하디안 선은 그대로 둡니다. Harderian 동맥은 때때로 틈새 막이 철회될 때 보입니다.참고 : 큰 백색 질량 또는 조직 고도가 nictitating 막이 제거 된 후 비강 또는 우수한 결막 영역에서 볼 경우, 멤브레인은 하디안 동맥이 자발적으로 탈출 할 수 있도록 베이스에 너무 가깝게 절제되었다. 후속 절차에서 이를 방지하기 위해, 기지에 틈새 멤브레인을 더 남겨 두십시오. 추가 조작이 이루어지거나 안구 표면 이수행되기 전에 안구 표면이 적어도 1 주 동안 치유될 수 있도록 하십시오. 4. 안구 건조 매개 변수 측정 및 눈물 샘플 수집 참고: 스터디 프로토콜 요구 사항(예: 기준선 및 그 이후 지정된 시간 점)을 기반으로 DED 매개 변수를 측정합니다. DED에 대한 측정은 매번 충실하게 복제하기 위해 엄격한 노력을 기울여 다음 순서로 수행해야 합니다. 일주기 변화를 최소화하기 위해 거의 같은 시간(±1시간)에 모든 동물을 테스트합니다. 이러한 측정은 일반적으로 두 명의 조사자의 팀이 필요합니다. 토끼를 제지 가방에 넣습니다. 온화한 과식을 유도하십시오. 눈물 삼투압22 눈꺼풀을 5-10회 수동으로 깜박여 눈표면에 눈물층을 고르게 분배합니다. 아래 뚜껑을 부드럽게 닫습니다. 아래 쪽축을 따라 palpebral 및 구근 결막의 접합부에서 TearLab Osmometer로 눈물을 흘리며, 잘린 틈새 멤브레인의 기저부 바로 뒤쪽을 따라 눈물을 흘립니다. 제조업체의 지침에 따라 TearLab 삼투압 테스트를 사용하여 삼투압을 측정합니다. 눈물 이별 시간 (TBUT) 이 분석의 방을 어둡게 합니다. 눈꺼풀 사이에 와이어 뚜껑 스페큘럼을 놓습니다. 마이크로파이펫을 사용하여 각막 표면에 0.2% 플루오레세인의 50 μL 드롭을 적용합니다. 각막에 불소의 분포가 첫 번째 방울로 얻어지지 않으면 두 번째 방울을 놓습니다. 즉시 타이머를 시작합니다. 푸른 빛 아래 각막 전 눈물 필름을 관찰. TBUT는 검은 점, 라인 또는 불소 필름의 명백한 중단을 개발하는 데 걸린 시간으로 정의됩니다(그림 4). 필요한 경우, +1.50 배율을 제공하는 외과 용 루페를 사용하여 이별의 조기 징후를 더 잘 시각화하십시오. 최대 1분 동안 모니터링하십시오. 여기에 정의 된 대로 나누기 1 분 후에 발생하는 경우, 만 60 s에 대한 TBUT를 기록합니다. 쉬르머의 눈물 테스트 (STT) 안구 표면에 방부제가 없는 리도카인 25 μL 드롭을 적용합니다. Weck 세포 외과 창을 열등한 포닉스에 넣고 잔류 리도카인및 눈물 액을 흡수합니다. 필요한 경우, 아래 눈꺼풀을 사용하여 스폰지의 근위 쪽 끝을 덮어 제자리에 보관하십시오(그림 5A). 약 30초 후에 Weck 스폰지를 제거합니다. 즉시 아래층 뚜껑의 중간 지점에서 각막과 팔피브랄 결막 사이의 공간에 Schirmer의 눈물 테스트 스트립을 삽입합니다. 즉시 타이머를 시작합니다(그림 5B). 5 분 후, 스트립의 축축한 부분의 길이를 측정; STT 값입니다. 세 배로 측정값을 수행하고 3개의 판독값의 평균을 STT 값으로 보고합니다. 눈물 샘플의 수집 락토페린과 같은 다양한 골수의 수치를 위한 눈물 샘플을 수집하기 위해, STT 값이 5분에 기록된 후, 적어도 20 mm의 습윤이 얻어질 때까지 스트립을 제자리에 둡니다.참고: DED가 유도된 후 적절한 습윤이 발생하지 않는 경우 스트립을 더 깊은 쪽으로 이동하여 적절한 시간에 이 종점에 도달할 수 있도록 하십시오. 촉촉한 스트립을 자르고 즉시 490 μL의 차가운 눈물 수집 버퍼 (4% BSA, 1M NaCl, 0.1% 트웬-20-20)를 단백질 분해 억제제 칵테일과 함께 PBS에 넣습니다. 샘플을 -80°C에서 보관할 수 있을 때까지 얼음 위에 보관하고 분석할 때까지 보관해야 합니다. 로즈 벵골 염색 (RBS) 마이크로 파이펫을 사용하여 각막에 1 % 방부제 프리 리도카인 50 μL을 적용하십시오. 30s 후, 안구 표면에 25 μL의 장미 벵골을 놓고 눈꺼풀을 수동으로 깜박여 고르게 분배하십시오. 즉시 타이머를 시작합니다. 3.5분 후, 뚜껑 사이에 와이어 뚜껑을 놓습니다. 4.0 분에서 우수한 결막과 각막 표면을 사진으로 촬영합니다(그림 6).참고: 사용 중인 카메라 유형에 맞게 조정합니다. 일반적인 설정: 디지털 단일 렌즈 반사 카메라, 조리개 우선 모드(조리개 13개 이상), ISO 6000, 100mm 매크로 렌즈 2개가 부착된 12.5mm 확장 튜브, 수동 초점 모드, 최대 배율의 렌즈, 매크로/링 플래시에서 자동으로 설정된 매크로/링 플래시의 조명. 링 플래시의 초점 램프가 켜져 각막에 초점을 맞출 수 있습니다. 1분 이내에 두 눈의 모든 사진을 완성합니다. NEI방법(23)을 이용하여 안구 표면 염색 점수는 다음과 같이 수정한다. 6 별도의 결막 영역을 채점하지 마십시오. 각 눈의 우수한 결막 점수를 매다. 이것은 지구를 조작하지 않고 쉽게 촬영 할 수있는 결막 표면의 부분입니다. 조작은 실제로 안구 표면의 얼룩을 바꿀 수 있습니다. 눈물 락토페린 수준은 눈물 땀샘에서 눈물 생산의 대리 측정이다. 분해술은 제조자의 지시에 따라 효소 연계 면역흡착분석법24 키트를 이용하여 위와 같이 수집된 눈물의 래토페린을 찢어버린다. 5. 안구 건조의 유도 및 치료 참고 : 궤도 물샘 시스템의 세 부분이 주입됩니다. 아세프로마진 0.2 mg/kg을 피하로 토끼를 진정시다. 주변 및 두피 부위의 털을 전단하고 Nair를 사용하여 잔류 모피를 완전히 제거합니다. 해부학 적 특징의 더 나은 시각화와 concanavalin A의 미국 가이드 주입을 위해 피부를 완전히 부드럽게 둡니다(그림 7). 전술한 바와 같이 적당한 과식을 유도한다. 우수한 상구선의 팔피브랄 부분의 주입 (PSLG)참고 : 먼저 PSLG의 주입을 수행합니다. 적절한 눈25 μL의 방부제 프리 리도카인 1%를 마이크로파이펫으로 바랄 수 있습니다. 위 눈꺼풀을 에버트하고 동맥의 점액 부위를 표시하는 protuberance가 보일 때까지 후방 궤도 림에 부드러운 내측 압력을 가합니다. PSLG는 상부 뚜껑의 후방(측두체) 부분에 작은 구근 고도로 나타납니다.참고 : 학습 과정에서 선 조직을 보려면 5 % 플루오레세인을 부위에 적용하십시오(그림 8A). 눈물은 구근 PSLG에서 스트리밍 볼 수 있습니다. Con A의 투여를 위해 플루오레세인의 적용이 필요하지 않다; 그것은 단지 선 조직을 보여주기 위해 그림 목적을 위해 수행됩니다. 결핵 주사기에 미세 톱니 집게와 27 게이지 바늘을 사용하여, 직접 트랜스 콘추시발 접근 방식을 사용하여 동맥을 관통. 바늘을 조직에 2mm 를 전진시키고 0.1 mL의 부피에서 500 μg의 Con A를 주입합니다(그림 8B).참고 : 이 주사는 때때로 고통스러울 수 있습니다. 필요한 경우, 이 주사가 완료 될 때까지 이소플루란 아래에 동물을 유지하십시오. 궤도 우수한 상구선 (OSLG)의 주입참고: OSLG는 연속적으로 진행됩니다. OSLG가 후방 에서 튀어 나오게하는 세계에 내측 압력을 적용하십시오 (필요한 경우 해부학의 경우 ref25 참조). 후방 에서 OSLG의 protuberance와 함께 지구(그림 9, 빨간색 화살표)에내측 압력을 적용합니다. protuberance는 후방 인장을 찾기 위해 총 국소화 역할을합니다. 두개골의 뼈 구멍이 느껴질 때까지 영역을 들여쓰기 위해 닫힌 팁이있는 곡선 집게를 사용합니다. 이것은 전방 / 후방 방향과 슬릿처럼 될 것입니다. 포셉으로 적당한 압력을 가하여 피부에 들여쓰기를 남기고 바늘 배치의 랜드 마크 역할을합니다(그림 10A). 삽입 표시를 통해 피부에 수직 바늘 (27 게이지, 5/8 인치 바늘 튜버 쿨린 주사기) 삽입 마크에 수직(그림 10B)~ 1/4 인치 를 삽입, 다음 주사 사이트와 뼈 궤도 림 사이의 중간 점을 목표로 측면 캔디를 향해 측면 캔디를 향해 바늘을 리디렉션.참고 : 인자가 바늘로 정확하게 표적으로하지 않으면 두개골이 발전을 막습니다. 바늘의 허브에 도달하면 0.2 mL(그림 10C)의 부피에서 1000 μg의 Con A를 천천히주입합니다. 2-3 분 이내에 PSLG와 OSLG 모두의 주입을 완료합니다. 이소플루란 진정제에서 동물을 제거하십시오 (아직 하지 않은 경우). 열등한 상구선(ILG)의 주입은 일반적으로 추가 적인 주사 없이 완료될 수 있다. 열등한 상아 동맥 의 주입 옆에서 동물을 볼 수 있습니다. ILG의 돌출부는 궤도의 하부 전방 부를 따라 볼 수있다(도 11A). 수술 마킹 펜 또는 ILG 선의 표면 부분이 zygomatic 뼈의 표면 (더 많은 외부) 휴식 장소에서 궤도의 더 많은 중간 위치로 전환하는 피부에 적합한 영구 마커를 사용하여 수직 선을 그립니다. 이는 전형적으로 전방 사지보다 열등하다(그림11A). 피부에이 라인을 가로 질러 수직으로 개최 미국 프로브를 청소하여 zygomatic 뼈의 끝을 식별합니다. ILG 전환은 선상 이미지가 명확하게 외경된 (zygomatic bone의 과반향 선이 이미지에서 선의 아래쪽 가장자리를 따라 보입니다)에서 인식 가능한 내측 테두리가없는 것으로 바뀌는 경우에 발생합니다 (zygomatic 골격 에코는 더 이상 존재하지 않습니다, 그림 1). 미국 화면에서 이러한 변경 사항을 표시하면 피부에 그려진 선에 대한 핸드피스의 상대적 위치를 관찰합니다. 이것은 Con A를 주어야하는 “사출 사이트”입니다. 주사의 깊이를 제어하여 Con A를 선내로 배치하여 zygomatic 아치 뼈에 내측하는 지점에 놓습니다. 다음과 같이 주입의 깊이를 결정: zygomatic 뼈의 깊이로 주입의 원하는 깊이를 설정 (hyperechoic 신호) 플러스 1 mm. 바늘의 알려진 길이에서이 값을 뺍니다 (이 예에서 15 mm). “주사 부위”~12 mm에서 선에 바늘을 삽입한 다음, 노출된 바늘의 길이가 신체 외부(수술용 캘리퍼스로 측정됨)가 5.8.6(도12)으로계산된 차이와 같을 때까지 천천히 철회한다. 0.2 mL에 콘 A 1000 μg를 주입하십시오.참고 : 땀샘의 캡슐이 관통되고 단순히 바늘에 의해 밀려되지 않도록하기 위해 바늘은 철수가 시작되기 전에 ~ 12mm 또는 거의 허브에 삽입해야합니다. 주사의 성공을 확인 하려면 미국을 반복. ILG는 특징적인 저반향 공간을 표시해야합니다(그림 1).참고 : ILG 주입은 동물(26)에 의해 가장 잘 용납하나, 따라서, 마지막으로 수행된다. 전체 절차를 완료하여 10 분 이내에 두 눈의 모든 땀샘을 주입하십시오. 이를 위해서는 절차에서 역량을 달성해야 합니다.참고: 2 궤도 해경 땀샘에 주사의 단일 세트는 급성 DED 지속 을 유도합니다 1-2 주. 더 긴 기간의 DED에 대 한, 정확 하 게 위의 Con A를 주입 7 일. 최대 6 개의 주사가 성공적으로 수행되었습니다. 6. 시술 후 진료 Con A를 주입한 후, 적어도 10-20분 동안 또는 마취 효과가 벗겨질 때까지 동물을 제지 봉투에 담아 모니터링하십시오. 동물들이 흉골 의전성을 유지하기에 충분한 의식을 되찾을 때까지 동물을 방치하지 마십시오. 완전히 회복될 때까지 개별 케이지로 되돌리지 마십시오. 시술 후 통증은 일반적으로 온화하고 48 시간 미만 지속됩니다. 필요한 경우 피하 케토롤락 (5 mg / kg)을 한 번 복용하십시오. 더 심한 통증에 대 한, 피하 buprenorphine를 제공 0.1 mg/kg 매 8 시간.