Un protocole in vitro pour évaluer les niveaux de microARN, les fonctions et les gènes cibles associés dans les cellules tumorales

Les microARN (miARN) sont les petites ARN réglementaires qui modulent principalement le processus de traduction et de dégradation des ARN messagers (ARM) en réagissant aux 3′ régions non traduites (3′ UTR) dans les gènes cibles de bonne foi¹. L’expression des miARN peut être réglée par des mécanismes transcriptionnels et post-transcriptionnels. Le déséquilibre de ces mécanismes de réglementation apporte des niveaux d’expression miRNAs incontrôlés et distinctifs dans de nombreuses maladies, y compris les cancers². Un seul miRNA peut avoir de multiples interactions avec divers ARNm. En conséquence, un ARNm individuel peut être contrôlé par divers miRNAs. Par conséquent, les réseaux de signalisation intracellulaire sont indirectement influencés par des miARN exprimés de façon distinctive par lesquels les troubles physiologiques et les maladies peuvent être initiés et détériorés^{2,3,4, 5 Annonces , 6}. Bien que l’expression altérée des miARN ait été observée dans divers types de cancers, les mécanismes moléculaires qui modulent les manières des cellules cancéreuses en conjonction avec des miARN sont encore largement inconnus.

L’accumulation des preuves a montré que les rôles oncogènes ou tumorales-suppresseurs des miARN dépendent des types de cancers. Par exemple, en ciblant la boîte de tête de fourche o3 (FOXO3), miR-155 favorise la prolifération cellulaire, la métastasie et la chimiorésistance du cancer colorectal^7,8. En revanche, la restriction de l’invasion de cellules de glioma est induite par miR-107 parl’intermédiaire de la régulation de la protéine d’homologaire neurogène d’entaille de locus 2 (NOTCH2) expression 9. L’évaluation des interactions miRNA-cible en relation avec les fonctions miRNA est une partie indispensable pour mieux comprendre comment les miARN régulent divers processus biologiques dans les états sains et malades¹⁰. En outre, la découverte de cibles de bonne foi (s) de miARN peut en outre fournir une stratégie affinée pour une thérapie miRNA-basée avec divers médicaments anticancéreux. Cependant, le principal défi dans le domaine des miRNAs est l’identification de cibles directes des miRNAs. Ici, des méthodes détaillées sont présentées comme des approches expérimentales reproductibles pour la détermination du gène cible miRNA. La conception expérimentale réussie de l’identification cible miRNA comporte diverses étapes et considérations (figure 1). La comparaison des niveaux mûrs de miRNA dans les cellules de tumeur et les cellules normales peut être l’une des procédures communes pour sélectionner un miRNA d’intérêt (Figure 1A). L’étude fonctionnelle d’un miRNA sélectionné pour détecter les effets d’un miRNA sur la prolifération cellulaire est importante pour réduire la liste des meilleures cibles candidates potentielles d’un miRNA d’intérêt (Figure 1B). Sur la base des fonctions expérimentalement validées des miARN, un examen systématique de la littérature et de la base de données en compagnie d’un programme de prédiction cible miRNA est nécessaire pour rechercher les informations les plus pertinentes sur les fonctions génétiques (figure 1C). L’identification de gènes cibles réels d’un miRNA d’intérêt peut être réalisée en mettant en œuvre des expériences telles que l’analyse de la luciferase avec le clonage de 3′ UTR d’un gène, PCR en temps réel, et le ballonnement occidental (Figure 1D). L’objectif du protocole actuel est de fournir des méthodes complètes d’expériences clés, la réaction en chaîne de polymérase en temps réel (PCR) basée sur la sonde, l’analyse de sulforhodamine B (SRB) suivant un miRNA imitant la transfection, la génération de courbes dose-réponse, et luciferase avec le clonage de 3′ UTR d’un gène. Le protocole actuel peut être utile pour une meilleure compréhension des fonctions des miARN individuels et de l’implication d’un miRNA dans la thérapie contre le cancer.