In vitro Getranscribeerd RNA-based Luciferase reporter assay om te studeren vertaling regelgeving in familie pokkenvirus-geïnfecteerde cellen
Summary
We presenteren een protocol om mRNA vertaling verordening in familie pokkenvirus-geïnfecteerde cellen met behulp van in vitro Getranscribeerd RNA-based Luciferase reporter assay studie. De analyse kan voor het bestuderen van Vertaal regelgeving door CIS-elementen van een mRNA worden gebruikt, met inbegrip van 5 ‘-onvertaalde regio (Utr) en 3 ‘-UTR. Verschillende Vertaal initiatie modi kunnen ook worden onderzocht met behulp van deze methode.
Abstract
Elke familie pokkenvirus mRNA die na virale replicatie van DNA wordt getranscribeerd heeft een evolutionair behouden, niet-malplaatjed 5 ‘-poly (A) leider in 5 ‘-UTR. Om de rol van 5 ‘-poly (A) leider in mRNA vertaling tijdens familie pokkenvirus besmetting te ontleden ontwikkelden wij een in vitro getranscribeerde RNA-based Luciferase reporter assay. Deze reporter assay bestaat uit vier kern stappen: (1) PCR om de DNA-template voor in vitro transcriptie te versterken; (2) transcriptie in vitro om mRNA te produceren gebruikend de polymerase van RNA (3) transfectie om in vitro getranscribeerd mRNA in cellen te introduceren; (4) detectie van Luciferase activiteit als indicator van de vertaling. De RNA-based Luciferase reporter assay beschreven hier omzeilt kwesties van plasmide replicatie in familie pokkenvirus-geïnfecteerde cellen en cryptische transcriptie van de plasmide. Dit protocol kan worden gebruikt om Vertaal regelgeving door CIS-elementen in een mRNA met inbegrip van 5 ‘-UTR en 3 ‘-UTR in andere systemen dan familie pokkenvirus-geïnfecteerde cellen te bepalen. Bovendien kunnen verschillende vormen van vertaling initiatie zoals Cap-afhankelijke, Cap-onafhankelijke, re-initiatie, en interne initiatie worden onderzocht met behulp van deze methode.
Introduction
Volgens het centrale dogma, de genetische informatiestromen van DNA aan RNA en dan tenslotte aan proteïne1,2. Deze stroom van genetische informatie is hoogst geregeld op vele niveaus met inbegrip van mRNA vertaling3,4. Ontwikkeling van verslaggever assays om regulering van genexpressie te meten zal het begrijpen van de regelgevende mechanismen die betrokken zijn bij dit proces te vergemakkelijken. Hier beschrijven wij een protocol om mRNA vertaling te bestuderen gebruikend een in vitro getranscribeerde RNA-gebaseerde Luciferase verslaggever assay in familie pokkenvirus-geïnfecteerde cellen.
Poxviruses bestaat uit vele zeer gevaarlijke menselijke en dierlijke pathogenen5. Net als alle andere virussen, poxviruses uitsluitend beroepen op host Cell machines voor de eiwitsynthese6,7,8. Om efficiënt te synthetiseren virale eiwitten, virussen geëvolueerd vele strategieën om mobiele translationele machines te kapen om het te omleiden voor de vertaling van virale mRNAs7,8. Een algemeen werkend mechanisme door virussen is het gebruik van CIS-Acting elementen in hun transcripten. Bekende voorbeelden zijn de interne ribosoom entry site (IRES) en Cap-Independent Translation Enhancer (cite)9,10,11. Deze CIS-elementen maken de virale transcripten een translationeel voordeel door het aantrekken van translationele machines via diverse mechanismen12,13,14. Meer dan 100 familie pokkenvirus mRNAs heeft een evolutionair behouden CIS-handelend element in 5 ‘-onvertaald gebied (5 ‘-UTR): een 5 ‘-poly (a) leider bij de zeer 5 ‘ einden van deze mRNAs15,16. De lengtes van deze 5 ‘-poly (a) leiders zijn heterogeen en door ontsporing van de familie pokkenvirus-gecodeerde polymerase van RNA tijdens transcriptie17,18geproduceerd. Wij, en anderen, ontdekten onlangs dat de 5 ‘-poly (a) leider een Vertaal voordeel aan mRNA in cellen verleent die met Vaccinia virus (VACV) worden besmet, het prototypic lid van poxviruses19,20.
De in vitro getranscribeerde RNA-based Luciferase reporter assay werd in eerste instantie ontwikkeld om de rol van 5 ‘-poly (a) leider in mRNA vertaling te begrijpen tijdens familie pokkenvirus infectie19,21. Hoewel de plasmide op DNA-gebaseerde Luciferase verslaggever analyses wijd zijn gebruikt, zijn er verscheidene nadelen die de resultaat interpretatie in familie pokkenvirus-besmette cellen zullen compliceren. Eerst, kunnen de plasmiden in VACV-besmette cellen repliceren22. Ten tweede, cryptische transcriptie komt vaak uit plasmide DNA18,23,24. Ten derde, VACV promotor-gedreven transcriptie genereert poly (A)-leider van heterogene lengtes waardoor het moeilijk is om de poly (A)-Leader lengte controle in sommige experimenten18. Een in vitro Getranscribeerd RNA-based Luciferase reporter assay omzeilt deze kwesties en de gegevensinterpretatie is eenvoudig.
Er zijn vier belangrijke stappen in deze methode: (1) de Kettingreactie van de polymerase (PCR) om het malplaatje van DNA voor in-vitro transcriptie te produceren; (2) in-vitro transcriptie voor het genereren van mRNA; (3) transfectie om mRNA in cellen te leveren; en (4) detectie van Luciferase activiteit als indicator van de vertaling (Figuur 1). Resulterende PCR amplicon bevat de volgende elementen in 5 ‘ aan 3 ‘ richting: de-promotor, poly (A) leider of gewenste 5 ‘-UTR opeenvolging, Firefly Luciferase open lezings kader (ORF) gevolgd door een poly (A) staart. PCR amplicon wordt gebruikt als malplaatje om mRNA door in-vitro transcriptie te synthetiseren gebruikend de polymerase van tempels. Tijdens in vitro transcriptie, m7G GLB of andere GLB Analog is opgenomen in nieuw gesynthetiseerde mRNA. De afgetopte transcripten zijn transfected in niet-geïnfecteerde of VACV-geïnfecteerde cellen. De cel lysate wordt verzameld op de gewenste tijd na transfectie om Luciferase activiteiten te meten die op eiwitproductie van transfected mRNA wijzen. Deze verslaggever analyse kan worden gebruikt om Vertaal regelgeving door CIS-element te bestuderen aanwezig in 5 ‘-UTR, 3 ‘-UTR of andere gebieden van mRNA. Voorts kan de in vitro getranscribeerde RNA-gebaseerde analyse worden gebruikt om verschillende mechanismen van Vertaal initiatie met inbegrip van GLB-afhankelijke initiatie, GLB-onafhankelijke initiatie, re-initiatie en interne initiatie zoals IRES te bestuderen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Alle vier-kern stappen zijn essentieel voor het succes van de in vitro getranscribeerde RNA-based Luciferase reporter assay. Speciale aandacht dient te worden besteed aan Primer design, met name voor de “propromotor” sequentie. De polymerase van RNA van 5′ begint transcriptie van de onderstreepte eerste G (gGG-UTR-aug-) in de promotor van de voor de 5 ‘-UTR opeenvolging toegevoegd. Hoewel de transcriptie Startsite (TSS) begint vanaf de eerste G aan de 5 ‘ einde, het verminderen van het aantal van G minder dan drie…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Het project werd gefinancierd door de nationale instituten van gezondheid (AI128406 www.nih.gov) aan ZY en gedeeltelijk door het onderzoekscentrum van de kanker van Johnson (http://cancer.k-state.edu) in de vorm van gediplomeerde student de zomer toelage aan PD.
Materials
| 2X-Q5 Master mix | New England Biolabs | M0492 | High-Fidelity DNA Polymerase used in PCR |
| 3´-O-Me-m7G(5')ppp(5')G RNA Cap Structure Analog | New England Biolabs | S1411L | Anti reverse Cap analog or ARCA |
| Corning 96 Well Half-Area white flat bottom polystyrene microplate | Corning | 3693 | Opaque walled 96 well white plate with solid bottom |
| Dual-Luciferase Reporter Assay System | Promega | E1960 | Dual-Luciferase Assay Kit (DLAK) |
| E.Z.N.A. Cycle Pure Kit | OMEGA BIO-TEK | D6492 | PCR purification kit |
| GloMax Navigator Microplate Luminometer | Promega | GM2010 | Referred as multimode plate reader luminometer |
| HiScribe T7 Quick High Yield RNA synthesis Kit | New England Biolabs | E2050S | In-Vitro transcription kit |
| Lipofectamine 2000 | Thermo Fisher Scientific | 11668019 | Cationic lipid transfection reagent |
| NanoDrop2000 | Thermo Fisher Scientific | ND-2000 | Used to measure DNA and RNA concentration |
| Opti-MEM | Thermo Fisher Scientific | 31985070 | Reduced serum media |
| Purelink RNA Mini Kit | Thermo Fisher Scientific | 12183018A | RNA purification kit |
| Vaccinia Capping System | New England Biolabs | M2080 | Capping system |
Referenzen
- Crick, F. H. On protein synthesis. Symposia of the Society for Experimental Biology. 12, 138-163 (1958).
- Crick, F. Central Dogma of Molecular Biology. Nature. 227, 561-563 (1970).
- Sonenberg, N., Hinnebusch, A. G. Regulation of Translation Initiation in Eukaryotes: Mechanisms and Biological Targets. Cell. 136, 731-745 (2009).
- Spriggs, K. A., Bushell, M., Willis, A. E. Translational Regulation of Gene Expression during Conditions of Cell Stress. Molecular Cell. 40, 228-237 (2010).
- Shchelkunov, S. N., Marennikova, S. S., Moyer, R. W. . Orthopoxviruses Pathogenic for Humans. , (2005).
- Gale, M., Tan, S. L., Katze, M. G. Translational Control of Viral Gene Expression in Eukaryotes. Microbiology and Molecular Biology Reviews. 64, 239-280 (2000).
- Walsh, D., Mathews, M. B., Mohr, I. Tinkering with Translation: Protein Synthesis in Virus-Infected Cells. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 5, a012351 (2013).
- Cao, S., Dhungel, P., Yang, Z. Going against the Tide: Selective Cellular Protein Synthesis during Virally Induced Host Shutoff. Journal of Virology. 91, e00071-e00017 (2017).
- Pelletier, J., Kaplan, G., Racaniello, V. R., Sonenberg, N. Cap-independent translation of poliovirus mRNA is conferred by sequence elements within the 5’ noncoding region. Molecular and Cellular Biology. 8, 1103-1112 (1988).
- Pelletier, J., Sonenberg, N. Internal initiation of translation of eukaryotic mRNA directed by a sequence derived from poliovirus RNA. Nature. 334, 320-325 (1988).
- Guo, L., Allen, E., Miller, W. A. Structure and function of a cap-independent translation element that functions in either the 3′ or the 5′ untranslated region. RNA. 6, 1808-1820 (2000).
- Simon, A. E., Miller, W. A. 3′ Cap-Independent Translation Enhancers of Plant Viruses. Annual Review of Microbiology. 67, 21-42 (2013).
- Marom, L., et al. Diverse poly(A) binding proteins mediate internal translational initiation by a plant viral IRES. RNA Biology. 6, 446-454 (2009).
- Liu, B., Qian, S. B. Translational reprogramming in cellular stress response. Wiley Interdisciplinary Review. RNA. 5, 301-305 (2014).
- Ahn, B. Y., Moss, B. Capped poly(A) leaders of variable lengths at the 5’ ends of vaccinia virus late mRNAs. Journal of Virology. 63, 226-232 (1989).
- Ahn, B. Y., Jones, E. V., Moss, B. Identification of the vaccinia virus gene encoding an 18-kilodalton subunit of RNA polymerase and demonstration of a 5’ poly(A) leader on its early transcript. Journal of Virology. 64, 3019-3024 (1990).
- Schwer, B., Visca, P., Vos, J. C., Stunnenberg, H. G. Discontinuous transcription or RNA processing of vaccinia virus late messengers results in a 5′ poly(A) leader. Cell. 50, 163-169 (1987).
- Yang, Z., Martens, C. A., Bruno, D. P., Porcella, S. F., Moss, B. Pervasive initiation and 3′ end formation of poxvirus post-replicative RNAs. Journal of Biological Chemistry. 287, 31050-31060 (2012).
- Dhungel, P., Cao, S., Yang, Z. The 5’-poly(A) leader of poxvirus mRNA confers a translational advantage that can be achieved in cells with impaired cap-dependent translation. PLOS Pathogens. 13, e1006602 (2017).
- Jha, S., et al. Trans-kingdom mimicry underlies ribosome customization by a poxvirus kinase. Nature. 546, 651-655 (2017).
- Dai, A., et al. Ribosome Profiling Reveals Translational Upregulation of Cellular Oxidative Phosphorylation mRNAs during Vaccinia Virus-Induced Host Shutoff. Journal of Virology. 91, e01858-e01816 (2017).
- De Silva, F. S., Moss, B. Origin-independent plasmid replication occurs in vaccinia virus cytoplasmic factories and requires all five known poxvirus replication factors. Journal of Virology. 2, 23 (2005).
- Yang, Z., Bruno, D. P., Martens, C. A., Porcella, S. F., Moss, B. Simultaneous high-resolution analysis of vaccinia virus and host cell transcriptomes by deep RNA sequencing. Proceedings of the National Academy of Sciences. 107, 11513-11518 (2010).
- Yang, Z., Bruno, D. P., Martens, C. A., Porcella, S. F., Moss, B. Genome-Wide Analysis of the 5′ and 3′ Ends of Vaccinia Virus Early mRNAs Delineates Regulatory Sequences of Annotated and Anomalous Transcripts. Journal of Virology. 85, 5897-5909 (2011).
- Lorenz, T. C. Polymerase Chain Reaction: Basic Protocol Plus Troubleshooting and Optimization Strategies. Journal of Visualized Experiments. , (2012).
- Dieffenbach, C. W., Lowe, T. M., Dveksler, G. S. General concepts for PCR primer design. PCR Methods and Applications. 3, S30-S37 (1993).
- Innis, M. A., Gelfand, D. H., Sninsky, J. J., White, T. J. . PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications. , (2012).
- Baklanov, M. M., Golikova, L. N., Malygin, E. G. Effect on DNA Transcription of Nucleotide Sequences Upstream to T7 Promoter. Nucleic Acids Research. 24, 3659-3660 (1996).
- Thornton, J. A. Splicing by Overlap Extension PCR to Obtain Hybrid DNA Products. The Genetic Manipulation of Staphylococci: Methods and Protocols. , 43-49 (2017).
- Akichika, S., et al. Cap-specific terminal N6-methylation of RNA by an RNA polymerase II–associated methyltransferase. Science. , (2018).
- Sun, H., Zhang, M., Li, K., Bai, D., Yi, C. Cap-specific, terminal N6-methylation by a mammalian m6Am methyltransferase. Cell Research. 1, (2018).
- Boulias, K., et al. Identification of the m6Am methyltransferase PCIF1 reveals the location and functions of m6Am in the transcriptome. bioRxiv. , 485862 (2018).
- Dominissini, D., Rechavi, G. N4-acetylation of Cytidine in mRNA by NAT10 Regulates Stability and Translation. Cell. 175, 1725-1727 (2018).
- Wei, J., et al. Differential m6A, m6Am, and m1A Demethylation Mediated by FTO in the Cell Nucleus and Cytoplasm. Molecular Cell. 71, 973-985 (2018).
- Fu, Y., Dominissini, D., Rechavi, G., He, C. Gene expression regulation mediated through reversible m6A RNA methylation. Nature Reviews Genetics. 15, 293-306 (2014).
