인간 배반포 생검 및 유리화
Summary
배반포 생검 및 유리화는 착상 전 유전자 검사를 효율적으로 수행하기 위해 필요합니다. 조나 펠루시다의 순차적 개방및 5-7일째에 7-8개의 트로페토더세포를 회수하는 접근법은 필요한 조작 횟수와 배아의 노출을 최적 이하의 환경 조건으로 제한한다.
Abstract
Blastocyst 생검은 착상 전 유전 시험을 가진 IVF 주기 도중 믿을 수 있는 유전 진단을 얻기 위하여 실행됩니다. 그런 다음, 이상적인 워크플로우에는 진단 기술의 처리 시간으로 인해 안전하고 효율적인 유리화 프로토콜이 수반되고, 선택된 배아를 다음과 같은 자연 주기에서 생리적 자궁 내막상으로 이송한다. 조나 펠루시다의 순차적 개방과 5-10 개의 영양 토내 세포 (이상적으로 7-8)의 검색을 포괄하는 생검 접근법은 필요한 조작 횟수와 배아의 노출을 최적 환경 조건에 모두 제한합니다. 적절한 훈련 후, 이 기술은 생검의 타이밍 (~8 분, 접시 당 생검에 대한 배아의 수에 따라 3-22 분 범위), 최종 진단을 얻은 (~ 97.5 %)에 걸쳐 다른 운영자에 걸쳐 재현 가능했다 그리고 생생한 출산율은 유혈모세포 전이(>40%)입니다. 생검, 유리화 및 온난화 후 생존율은 99.8%로 높았다. 온난화에서 1.5 h에서 재 팽창 속도 는 97%로 높았다, 주로 생검과 유리화 사이의 타이밍에 의존 (이상적으로 ≤30 분), 배반 세포 형태학적 품질과 생검의 날. 일반적으로 붕괴 된 배반포를 vitrify하는 것이 좋습니다. 따라서, 비 PGT 주기에서, 레이저 지원 인공 수축 은 동결 보존 전에 배아 붕괴를 유도하기 위해 수행 될 수있다. 가장 유망한 미래 관점은 배아 DNA의 가증한 근원으로서 배반포 배양 후 IVF 배양 배지의 비침습적 분석이다. 그러나 이 잠재적아방가르드는 아직 조사 중이며 신뢰할 수 있는 프로토콜을 정의하고 검증해야 합니다.
Introduction
현대 인간 발생학의 주요 목표는 자극된 주기 당 출생 수를 최대화하고 임신을 달성하기 위하여 비용, 시간 및 노력을 감소시키는 것입니다. 이 목표를 달성하기 위하여는, 태아 선택을 위한 검증된 접근은 IVF 주기 도중 장악된 코호트 내의 생식 유능한 태아를 확인하기 위하여 이용되어야 합니다. 최신 증거에 따르면, blastocyst 배양 1은 포괄적인 염색체 검사 및 유리화 온난화 된 유엽태아 전달 (ET)과 결합되어 IVF 효율을 높이는 가장 효율적인 프레임 워크2이다. 분명히, 이수성 검사는 현재 주로 trophectoderm (TE)에서 검색 된 몇 가지 세포에서 표현되는 배아 표본을 필요로, 즉, 임신 중 배아 부속서 (예를 들어, 태반)에 기원을 제공하는 배반포의 섹션 . karyotype 분석을 넘어, 또한 단 하나 유전자 돌연변이는 착상 전 유전 시험으로 알려져 있는 임상 전략의 한 부분으로 TE 생검에서 평가될 수 있습니다 (PGT; -A 는 이수화에 대한, 구조 염색체 재배열을 위한 -SR, 단조로운 질병을 위한 -M). 그밖 난모세포/배아 생검 방법은 지난 십년간, 즉 극성 바디 생검 및 blastomere 생검을 통해 임상으로 이론화되고 채택되었습니다. 그러나, 그들의 사용은 그들의 절차적 단점 (예를 들어, 더 높은 워크로드 및 생식 영향에 대한 위험) 및 진단 한계 (예를 들어, 단일 세포 분석 문제)가 암시적으로 비용, 위험 및 및 사이의 충분한 균형을 방해하기 때문에 요즘 감소됩니다. (리뷰는3참조).
이 백서에서 TE 생검을 위한 주요 프로토콜 중 하나는 필요한 후속 유리화, 온난화 및 전달 절차와 함께 철저히 설명됩니다. 여기에 설명된 워크플로는 바쁜 PGT 장치에 이상적입니다.
이미 우리 그룹4,5에의해 이전에 설명한 바와 같이, 절차는 완전히 확장 된 배반포의 조나 펠루시다의 순차적 개방과 몇 가지 TE 세포의 제거를 포함한다 (평균 7-8). 3 일 레이저 보조 부화 기반 배반 포동 생검 방법6에비해,이 절차는 배반 세포 생검 및 유리화와 같은 섬세한 절차가 적시에 수행되어야하는 IVF 장치의 일일 일정을 완화 할 수 있습니다. 배반포가 완전한 확장에 도달하자마자, 생검은 제거하는 TE 세포를 선택하여 수행될 수 있고, 따라서 그렇지 않으면 절차를 도전하게 하는 내부 세포 질량 (ICM)의 탈장의 리스크를 방지합니다. 문헌에서, 배반포 생검의 제 3 프로토콜은 또한 설명되었습니다, 이는 배아가 이미 배반포 단계에 도달하면 수행되는 레이저보조 부화포함, 절차 5,7전에 몇 시간. 그러나, 이 접근법은 시간이 더 많이 소요되며 주로 제한된 숙련된 운영자의 손에 TE 생검을 구현하는 IVF 단위에 적합하며, 이는 보통 낮음의 일일 워크로드를 고려할 때 입니다.
Intracytoplasmatic 정액 주입 (ICSI)8 는 IVF에 있는 유전 분석을 실행하기 위하여 겨냥하는 경우에 통합한 기술이어야 합니다. 유사하게, 배아를 배반포 단계로 안전하게 수확하는 적절한 배양 시스템은 TE 생검 전략의 구현에 매우 중요하다. 적절한 수의 인큐베이터뿐만 아니라 낮은 산소 장력의 사용은 배반포 속도 9를 손상시키지 않는이 단원의 주요 전제 조건입니다. 동시에 PGT 주기를 안전하게 관리하기 위해서는 효율적인 냉동 보존 프로그램이 필요합니다. 지난 10 년간, 유리화의 구현은 배아 극저온 생존율을 >99%10,11까지증폭시켰습니다. 이것은 유전자 검사를 수행하고 다음 생리주기로 배아 전달을 연기하기에 충분한 시간을 제공, 비 자극 아마 더 수용 자궁 내막에12.
TE 생검과 유리화 는 엄격한 기술을 요구하는 작업을 요구하고 있으며 그 효과는 경험이없는 운영자에 따라 다를 수 있습니다. 따라서 각 작업자가 이러한 절차를 임상적으로 수행할 수 있도록 하기 전에 특정 교육 기간이 주어지며, 또한, 냉동 보존 및 생검 절차에 대한 핵심 성과 지표(KPI)를 모니터링하여 운영자의 기술 유지를 주기적으로 평가해야 합니다. 각 IVF 클리닉은 내부 KPI를 이를 위해 설정해야 하며, 이는 국제 컨소시엄이 발표한 KPI 및/또는 참조 실험실에서 발표한 결과를 근사화해야 합니다.
TE 생검, 유리화 온난화 및 목격 절차는 3개의 이전 간행물11,13,14에 보고된 대로 관련된 모든 사업자에 걸쳐 표준화된 우리의 단위에 있는 기술을 검증됩니다 .
Protocol
Representative Results
Discussion
훈련 기간을 마친 숙련된 숙련된 배아학자만이 TE 생검과 배반포 유리화를 모두 수행해야 합니다. 또한, 생검 접시에서 생검 된 배반포의 움직임을 시술 을 모니터링하고 효율적인 추적성을 보장하기 위해 증인이 필요합니다 (보충그림1) 생검 후 접시에 (보충그림 1) ), 다음 유리화 판(보충 도1) 및 마지막으로 유리화 지지체 (보조도1); ii) 생검접시…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
AG와 RM은 데이터를 수집하고 원고를 작성했습니다. DC는 데이터를 분석하고, 대표 결과를 작성하고, 통계를 수행하고, 원고를 수정했습니다. FMU와 LR은 결과와 전체 원고에 대한 비판적 인 토론을 제공했습니다.
Materials
| Equipment | |||
| Cold tube rack | Biocision | XTPCR96 | |
| Electronic pipette controller | Fisher Scientific | 710931 | |
| Flexipet adjustable handle set | Cook | G18674 | Stripper holder |
| Gilson Pipetman | Gilson | 66003 | p20 |
| IVF Electronic Witness System | CooperSurgical Fertility & Genomic Solutions | RI Witness ART Management System | |
| Inverted microscope | Nikon | Eclipse TE2000-U | |
| Laminar Flow Hood | IVF TECH | Grade A air flow | |
| Laser objective | RI | Saturn 5 | |
| Microinjectors | Nikon Narishige | NT-88-V3 | |
| Mini centrifuge for PCR tubes | Eppendorf | CSLQSPIN | for 0.2ml PCR tubes |
| Stereomicroscope | Leica | Leica M80 | |
| Thermostat | Panasonic | MCO-5AC-PE | |
| Tri-gas incubator | Panasonic | MCO-5M-PE | 02/CO2 |
| Consumables | |||
| Biopsy pipette | RI | 7-71-30FB35720 | 30µm ID, flat 35°C |
| Cryolock | Cryolock | CL-R-CT | |
| CSCM complete | Irvine Scientific | 90165 | IVF culture medium supplemented with HSA |
| Embryo Transfer Catheter | Cook | G17934 | |
| Flexipet pipette | Cook | G26712 | 140µm stripping pipette tip |
| Flexipet pipette | Cook | G46020 | 300µm stripping pipette tips |
| Holding pipette | RI | 7-71-IH35/20 | 30µm ID, flat 35°C |
| Human Serum Albumin | Irvine Scientific | 9988 | |
| IVF One well dish | Falcon | 353653 | |
| Mineral Oil for embryo culture | Irvine Scientific | 9305 | |
| Modified HTF Medium | Irvine Scientific | 90126 | Hepes-Buffered medium |
| Nuclon Delta Surface | Thermofisher scientific | 176740 | IVF dish 4-well plate with sliding lid |
| Primaria Cell culture dish | Corning | 353802 | 60x15mm |
| Reproplate | Kitazato | 83016 | |
| Serological pipette | Falcon | 357551 | 10ml |
| Sterile disposable Gilson tips | Eppendorf | 0030 075.021 | 200µl |
| Tubing Kit | Provided by the genetic lab | PCR tubes (0.2mL), loading solution, biopsy washing solution | |
| Vitrification media | Kitazato | VT801 | Equilibration and vitrification solutions |
| Warming media | Kitazato | VT802 | Thawing and dilution solutions |
Referenzen
- Glujovsky, D., Farquhar, C., Quinteiro Retamar, A. M., Alvarez Sedo, C. R., Blake, D. Cleavage stage versus blastocyst stage embryo transfer in assisted reproductive technology. Cochrane Database of Systematic Reviews. (6), CD002118 (2016).
- Dahdouh, E. M., Balayla, J., Garcia-Velasco, J. A. Comprehensive chromosome screening improves embryo selection: a meta-analysis. Fertility and Sterility. 104 (6), 1503-1512 (2015).
- Cimadomo, D., et al. The Impact of Biopsy on Human Embryo Developmental Potential during Preimplantation Genetic Diagnosis. Biomedical Research International. 2016, 7193075 (2016).
- Capalbo, A., et al. Correlation between standard blastocyst morphology, euploidy and implantation: an observational study in two centers involving 956 screened blastocysts. Human Reproduction. 29 (6), 1173-1181 (2014).
- Capalbo, A., et al. Implementing PGD/PGD-A in IVF clinics: considerations for the best laboratory approach and management. Journal of Assisted Reproduction and Genetics. , (2016).
- McArthur, S. J., Leigh, D., Marshall, J. T., de Boer, K. A., Jansen, R. P. Pregnancies and live births after trophectoderm biopsy and preimplantation genetic testing of human blastocysts. Fertility and Sterility. 84 (6), 1628-1636 (2005).
- Kokkali, G., et al. Birth of a healthy infant following trophectoderm biopsy from blastocysts for PGD of beta-thalassaemia major. Human Reproduction. 20 (7), 1855-1859 (2005).
- Rienzi, L., Ubaldi, F., Anniballo, R., Cerulo, G., Greco, E. Preincubation of human oocytes may improve fertilization and embryo quality after intracytoplasmic sperm injection. Human Reproduction. 13 (4), 1014-1019 (1998).
- Wale, P. L., Gardner, D. K. The effects of chemical and physical factors on mammalian embryo culture and their importance for the practice of assisted human reproduction. Human Reproduction Update. 22 (1), 2-22 (2016).
- Rienzi, L., et al. Oocyte, embryo and blastocyst cryopreservation in ART: systematic review and meta-analysis comparing slow-freezing versus vitrification to produce evidence for the development of global guidance. Human Reproduction Update. 23 (2), 139-155 (2017).
- Cimadomo, D., et al. Associations of blastocyst features, trophectoderm biopsy and other laboratory practice with post-warming behavior and implantation. Human Reproduction. , (2018).
- Evans, J., et al. Fresh versus frozen embryo transfer: backing clinical decisions with scientific and clinical evidence. Human Reproduction Update. 20 (6), 808-821 (2014).
- Capalbo, A., et al. Consistent and reproducible outcomes of blastocyst biopsy and aneuploidy screening across different biopsy practitioners: a multicentre study involving 2586 embryo biopsies. Human Reproduction. 31 (1), 199-208 (2016).
- Cimadomo, D., et al. Failure mode and effects analysis of witnessing protocols for ensuring traceability during PGD/PGS cycles. Reproductive Biomedicine Online. 33 (3), 360-369 (2016).
- Gardner, D. K., Schoolcraft, B., Jansen, R., Mortimer, D. . Towards Reproductive Certainty: Infertility and Genetics Beyond 1999. , 377-388 (1999).
- Cimadomo, D., et al. Inconclusive chromosomal assessment after blastocyst biopsy: prevalence, causative factors and outcomes after re-biopsy and re-vitrification. A multicenter experience. Human Reproduction. , (2018).
- de Boer, K. A., Catt, J. W., Jansen, R. P., Leigh, D., McArthur, S. Moving to blastocyst biopsy for preimplantation genetic diagnosis and single embryo transfer at Sydney IVF. Fertility and Sterility. 82 (2), 295-298 (2004).
- Capalbo, A., Rienzi, L. Mosaicism between trophectoderm and inner cell mass. Fertility and Sterility. 107 (5), 1098-1106 (2017).
- McCoy, R. C., et al. Evidence of Selection against Complex Mitotic-Origin Aneuploidy during Preimplantation Development. PLoS Genetics. 11 (10), e1005601 (2015).
- Scott, R. T., Upham, K. M., Forman, E. J., Zhao, T., Treff, N. R. Cleavage-stage biopsy significantly impairs human embryonic implantation potential while blastocyst biopsy does not: a randomized and paired clinical trial. Fertility and Sterility. 100 (3), 624-630 (2013).
- Lee, H., et al. Live births after transfer of rebiopsy and revitrification of blastocyst that had “no diagnosis” following trophectoderm biopsy. Fertility and Sterility. 106 (3), e164 (2016).
- Capalbo, A., et al. Diagnostic efficacy of blastocoel fluid and spent media as sources of DNA for preimplantation genetic testing in standard clinical conditions. Fertility and Sterility. 110 (5), 870-879 (2018).
- Hammond, E. R., Shelling, A. N., Cree, L. M. Nuclear and mitochondrial DNA in blastocoele fluid and embryo culture medium: evidence and potential clinical use. Human Reproduction. 31 (8), 1653-1661 (2016).
- Vera-Rodriguez, M., et al. Origin and composition of cell-free DNA in spent medium from human embryo culture during preimplantation development. Human Reproduction. 33 (4), 745-756 (2018).
