호중구 계보 세포의 질량 세포 분석 분석을위한 전체 골수의 준비
Summary
여기서, 우리는 호중구 계보 세포의 고차원 질량 세포측정 (비행 시간, CyTOF에 의한 세포 측정) 분석을 위해 마우스 또는 인간으로부터 분리 된 신선한 골수 (BM)를 처리하는 프로토콜을 제시한다.
Abstract
이 문서에서는, 우리는 전체 BM CyTOF 분석을 위한 신선한 BM에 있는 호중구 계보 세포를 보존하기 위하여 최적화된 프로토콜을 제시합니다. 우리는 골수성 편향 된 39 항체 CyTOF 패널을 사용하여이 프로토콜을 사용하여 호중구 혈통 세포에 초점을 맞춘 조혈 시스템을 평가했습니다. CyTOF 결과는 오픈 리소스 차원 감소 알고리즘, viSNE로 분석되었고, 데이터는 이 프로토콜의 결과를 입증하기 위해 제시되었다. 우리는 이 프로토콜에 근거를 둔 새로운 호중구 혈통 세포 인구를 발견했습니다. 신선한 전체 BM 제제의 이 프로토콜은 1), 전체 BM에서 확인되지 않은 세포 집단을 발견하기 위해 CyTOF 분석을 위해 사용될 수 있습니다, 2), 백혈병과 같은 혈액 장애를 가진 환자를 위한 전체 BM 결점을 조사하는, 3), 의 최적화를 지원 신선한 전체 BM을 활용하는 형광 활성화 유동 세포 분석 프로토콜.
Introduction
지난 수십 년 동안, 세포 분석 방법은 BM의 조혈 시스템을 조사하는 강력한 도구되었습니다. 이러한 방법은 중금속 표지 항체를 사용하여 형광 활성화 유동 세포 분석 및 CyTOF의 새로운 방법을 포함한다. 그(것)들은 그들의 유일한 표면 마커 발현 단면도의 확인에 의하여 이기종 생물학 견본에 있는 많은 세포 모형의 발견으로 이끌어 냈습니다. 더 많은 채널과 관련된 스펙트럼 중복이 증가하면 형광 활성화 유동 세포 분석 애플리케이션에서 더 높은 데이터 부정확성이 발생합니다. 따라서, 불순한 세포는 형광 활성화 유동 세포 분석 분석을 위한 관심있는 세포 인구를 풍부하게 하기 위하여 일상적으로 제거됩니다. 예를 들어, Ly6G (또는 Gr-1) 및 CD11b는 성숙한 골수성 세포 마커로 간주되며 Ly6G+ (또는 Gr-1+) 및 CD11b+ 세포는 유세포 분석 전에 자기 농축 키트를 사용하여 BM 샘플에서 일상적으로 제거됩니다. 조혈 줄기 및 전구 세포 (HSPC) 또는 하나의 덤프 칵테일 채널 1,2,3에이러한 마커를 결합하여. 또 다른 예는 호중구가 면역학 연구를 위한 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC)를 풍부하게 하기 위하여 인간적인 혈액 견본에서 일상적으로 제거된다는 것입니다. 마우스 또는 인간에서 격리된 전체 골수는, 그러나, 세포 측정 분석을 위해 손상되지 않는 조사되지 않습니다.
최근 CyTOF는 조혈 계 4,5,6을조사하는 혁신적인 도구가되었습니다. CyTOF를 사용하면 불소 표지 된 항체가 무거운 원소 리포터 표지 된 항체로 대체됩니다. 이 방법을 사용하면 스펙트럼 중복의 염려 없이 동시에 40개 이상의 마커를 측정할 수 있습니다. 사전 고갈 단계 또는 덤프 채널없이 그대로 생물학적 시편의 분석을 가능하게했다. 따라서, 우리는 기존의 2차원 유동 세포분석 플롯에서 고함량 치수성으로 조혈계를 종합적으로 볼 수 있습니다. 고갈 또는 게이팅 공정 동안 과거에 생략된 세포 집단은 이제 CyTOF4,5에의해 생성된 고차원 데이터로 빛을 가져올 수 있다. 우리는 동시에 골수성 보리 7에 초점을 맞춘 조혈 시스템에서 39 개의 매개 변수를측정하는 항체 패널을 설계했습니다. 기존의 유세포분석 데이터와 비교할 때 CyTOF에 의해 생성된 전례 없는 단세포 고차원 데이터의 해석과 시각화는 매우 까다롭습니다. 전산 과학자들은 고차원 데이터 세트의 시각화를 위한 차원 감소 기술을 개발했습니다. 이 문서에서는 T-분산 형 핵 종자 포함 (t-SNE) 기술을 사용하여 CyTOF 데이터를 분석하고 고차원 구조를 보존하면서 2 차원지도에 고차원 결과를 제시하는 알고리즘 viSNE을 사용했습니다. 데이터 8,9,10. tSNE 플롯에서 유사한 셀이 하위 집합으로 클러스터되고 색상이 셀의 특징을 강조 표시하는 데 사용됩니다. 예를 들어, 도 1에 대해 골수성 세포는 CyTOF(도1)4로부터 유래된 33개의 표면 마커의발현 패턴의 유사성에 기초하여 여러 세포 서브세트로 분포된다. 여기에서 우리는 viSNE 분석 7에 의하여 우리의 이전에 보고된 39마커 CyTOF 패널을 가진 마우스 골수를 조사했습니다. 우리의 CyTOF 데이터의 viSNE 분석은 HSPC (CD117 ++) 및 호중구 (Ly6G+) 특성 을 모두 보여 준 미확인 세포 집단을 밝혀냈다 (도2)7.
결론적으로, 우리는 CyTOF 분석을 위한 신선한 전체 골수를 처리하는 프로토콜을 제시합니다. 이 문서에서는, 우리는 예를 들면 마우스 골수를 이용했습니다, 이 프로토콜은 또한 인간적인 골수 견본을 가공하기 위하여 이용될 수 있는 동안. 인간 골수 견본에 특정한 세부 사항은 또한 프로토콜에서 또한 주의됩니다. 이 프로토콜의 장점은 전체 골수에 대한 조사를 가능하게하기 위해 전체 골수에서 호중구 혈통 세포를 보존하도록 최적화 된 인큐베이션 시간 및 온도와 같은 세부 사항을 포함하고 있다는 것입니다. 이 프로토콜은 또한 형광 활성화 유동 세포 분석 응용 프로그램에 대해 용이하게 수정될 수 있다.
Protocol
Representative Results
Discussion
지난 수십 년 동안, 형광 계류 세포측정은 세포 혈통 및 이질성을 연구하는 주요방법으로 사용되었다 1,2,3. 유세포측정법이 다차원 데이터를 제공했지만 이 방법은 매개 변수 와 스펙트럼 중복의 선택에 의해 제한됩니다. 유세포 분석의 약점을 극복하기 위해 우리는 형광단 대신 중금속 동위원소를 사용하여 검출기 채널 또는 …
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
우리는 대량 세포 분석 절차에 도움을 LJI 흐름 세포 분석 코어에 감사드립니다. 이 작품은 NIH 보조금 R01HL134236, P01HL136275 및 R01CA202987 (모두 C.C.H) 및 ADA7-12-MN-31 (04) (C.C.H. 및 Y.P.Z)에 의해 지원되었다.
Materials
| CyTOF Antibodies (mouse) | |||
| Anti-Mouse CD45 (Clone 30-F11) -89Y | Fluidigm | Cat# 3089005B | |
| Anti-Human/Mouse CD45R/B220 (Clone RA36B2)-176Yb | Fluidigm | Cat# 3176002B | |
| Anti-mouse CD105 (Clone MJ7/18)-Purified | Biolegend | Cat# 120402; RRID:AB_961070 | |
| Anti-mouse CD115 (CSF-1R) (Clone AFS98)-Purified | Biolegend | Cat# 135502; RRID:AB_1937293 | |
| Anti-Mouse CD117/c-kit (Clone 2B8)-166Er | Fluidigm | Cat# 3166004B | |
| Anti-mouse CD11a (Clone M17/4)-Purified | Biolegend | Cat# 101101; RRID:AB_312774 | |
| Anti-Mouse CD11b (Clone M1/70)-148Nd | Fluidigm | Cat# 3148003B | |
| Anti-Mouse CD11c (Clone N418)-142Nd | Fluidigm | Cat# 3142003B | |
| Anti-mouse CD127 (IL-7Rα) (Clone A7R34)-MaxPar Ready | Biolegend | Cat# 133919; RRID:AB_2565433 | |
| Anti-Mouse CD150 (Clone TC1512F12.2)-167Er | Fluidigm | Cat# 3167004B | |
| Anti-mouse CD16.2 (FcγRIV) (Clone 9E9)-Purified | Biolegend | Cat# 149502; RRID:AB_2565302 | |
| Anti-Mouse CD162 (Clone 4RA10 (RUO))-Purified | BD Biosciences | Cat# 557787; RRID:AB_647340 | |
| Anti-mouse CD169 (Siglec-1) (Clone 3D6.112)-Purified | Biolegend | Cat# 142402; RRID:AB_10916523 | |
| Anti-mouse CD182 (CXCR2) (Clone SA044G4)-Purified | Biolegend | Cat# 149302; RRID:AB_2565277 | |
| Anti-mouse CD183 (Clone CXCR3-173)-Purified | Biolegend | Cat# 126502; RRID:AB_1027635 | |
| Anti-mouse CD335 (NKp46) (Clone 29A1.4)-MaxPar Ready | Biolegend | Cat# 137625; RRID:AB_2563744 | |
| Anti-mouse CD34 (Clone MEC14.7)-Purified | Biolegend | Cat# 119302; RRID:AB_345280 | |
| Anti-mouse CD41 (Clone MWReg30)-MaxPar Ready | Biolegend | Cat# 133919; RRID:AB_2565433 | |
| Anti-Mouse CD43 (Clone S11)-146Nd | Fluidigm | Cat# 3146009B | |
| Anti-Mouse CD48 (Clone HM48.1)-156Gd | Fluidigm | Cat# 3156012B | |
| Anti-mouse CD62L (Clone MEL-14)-MaxPar Ready | ThermoFisher | Cat# 14-1351-82; RRID:AB_467481 | |
| Anti-mouse CD71 (Clone RI7217)-Purified | Biolegend | Cat# 113802; RRID:AB_313563 | |
| Anti-mouse CD90 (Clone G7)-Purified | Biolegend | Cat# 105202; RRID:AB_313169 | |
| Anti-Mouse F4/80 (Clone BM8)-159Tb | Fluidigm | Cat# 3159009B | |
| Anti-mouse FcεRIα (Clone MAR-1)-MaxPar Ready | Biolegend | Cat# 134321; RRID:AB_2563768 | |
| Anti-mouse GM-CSF (MP1-22E9 (RUO))-Purified | BD Biosciences | Cat# 554404; RRID:AB_395370 | |
| Anti-Mouse I-A/I-E (Clone M5/114.15.2)-174Yb | Fluidigm | Cat# 3174003B | |
| Anti-Mouse Ki67 (Clone B56 (RUO))-Purified | BD Biosciences | Cat# 556003; RRID:AB_396287 | |
| Anti-Mouse Ly-6A/E (Sca-1) (Clone D7)-169Tm | Fluidigm | Cat# 3169015B | |
| Anti-Mouse Ly6B (Clone 7/4)-Purified | abcam | Cat# ab53457; RRID:AB_881409 | |
| Anti-mouse Ly-6G (Clone 1A8)-MaxPar Ready | Biolegend | Cat# 127637; RRID:AB_2563784 | |
| Anti-Mouse NK1.1 (Clone PK136)-165Ho | Fluidigm | Cat# 3165018B | |
| Anti-Mouse Siglec-F (Clone E50-2440 (RUO))-Purified | BD Biosciences | Cat# 552125; RRID:AB_394340 | |
| Anti-Mouse TCRβ (Clone H57-597)-143Nd | Fluidigm | (Clone H57-597)-143Nd | |
| Anti-mouse TER-119/Erythroid Cells (Clone TER-119)-MaxPar Ready | Biolegend | Cat# 116241; RRID:AB_2563789 | |
| Chemicals, Peptides and Recombinant Proteins | |||
| Antibody Stabilizer | CANDOR Bioscience | Cat# 130050 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | Cat# A4503 | |
| Cisplatin-194Pt | Fluidigm | Cat# 201194 | |
| eBioscience 1X RBC Lysis Buffer | ThermoFisher | Cat# 00-4333-57 | |
| eBioscience Foxp3 / Transcription Factor Staining Buffer Set | ThermoFisher | Cat# 00-4333-57 | |
| EQ Four Element Calibration Beads | Fluidigm | Cat# 201078 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | ThermoFisher | Cat# AM9260G | |
| Fetal Bovine Serum | Omega Scientific | Cat# FB-02 | |
| HyClone Phosphate Buffered Saline solution | GE Lifesciences | Cat#SH30256.01 | |
| Intercalator-Ir | Fluidigm | Cat# 201192B | |
| MAXPAR Antibody Labeling Kits | Fluidigm | http://www.dvssciences.com/product-catalog-maxpar.php | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | Cat# 158127 | |
| Sodium azide | Sigma-Aldrich | Cat# S2002 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | Cat# X100 | |
| Trypsin EDTA 1X | Corning | Cat# 25-053-Cl | |
| Experimental Model: Organism/Strains | |||
| Mouse: C57BL/6J | The Jackson Laboratory | Stock No: 000664 | |
| Software Alogrithm | |||
| Bead-based Normalizer | Finck et al., 2013 | https://med.virginia.edu/flow-cytometry-facility/wp-content/uploads/sites/170/2015/10/3_Finck-Rachel_CUGM_May2013.pdf | |
| Cytobank | Cytobank | https://www.cytobank.org/ | |
| Cytofkit v1.r.0 | Chen et al., 2016 | https://bioconductor.org/packages/release/bioc/html/cytofkit.html | |
| t-SNE | van der Maaten and Hinton, 2008 | https://cran.r-project.org/web/packages/Rtsne/index.html | |
Referenzen
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