全骨髓的制备,用于中性粒系细胞的大规模细胞测定分析

在过去的几十年中,细胞学方法一直是研究BM造血系统的有力工具。这些方法包括荧光活化流细胞测定法和采用重金属标记抗体的CyTOF新方法。通过鉴定其独特的表面标记表达特征,它们在异质生物标本中发现了许多细胞类型。增加的频谱重叠与更多的通道相关,导致荧光激活流细胞学应用中的数据误差更高。因此,为了丰富荧光激活流细胞学分析感兴趣的细胞群,通常会去除不需要的细胞。例如,Ly6G(或Gr-1)和CD11b被视为成熟的骨髓细胞标记,Ly6G⁼ (或Gr-1⁺) 和CD11b⁺细胞在流式细胞测定分析之前,通常使用磁性浓缩试剂盒从BM样品中取出。造血干细胞和祖细胞(HSPCs)或将这些标记物组合在一个转储鸡尾酒通道1,2,3。另一个例子是,中性粒细胞经常从人类血液标本中取出,以丰富外周血单核细胞(PBMC),用于免疫学研究。然而,从小鼠或人类分离出的整个骨髓很少被完整地研究为细胞学分析。

最近,CyTOF已成为研究造血系统4,5,6的革命性工具。使用CyTOF,荧光度标记抗体被重元素报告标记抗体所取代。此方法允许同时测量 40 多个标记,而不必担心频谱重叠。它使完整的生物标本能够进行分析,无需预消耗步骤或转储通道。因此,我们可以从传统的二维流式细胞学图中,以高含量的维数全面地观察造血系统。过去在消耗或浇注过程中省略的细胞群现在可以使用CyTOF4,5生成的高维数据来揭示。我们设计了一个抗体面板,同时测量造血系统中的39个参数,重点是骨髓性linage^7。与传统流式细胞测量数据相比,CyTOF生成的前所未有的单细胞高维数据的解释和可视化具有挑战性。计算科学家已经开发了用于高维数据集可视化的维数缩减技术。在本文中,我们使用使用 t 分布随机邻域嵌入 (t-SNE) 技术的算法 viSNE 来分析 CyTOF 数据,并在二维地图上显示高维结果,同时保护高维结构数据8,9,10。在 tSNE 图中,类似的单元格被聚入子集,颜色用于突出显示单元格的特征。例如,在图1中,骨髓细胞根据CyTOF(图1)4产生的33个表面标记的表达模式的相似性,分布到多个细胞集中。在这里,我们研究了小鼠骨髓与我们之前报告的39标记CyTOF面板通过viSNE分析7。viSNE分析我们的CyTOF数据显示一个不明的细胞群,显示HSPC (CD117⁺⁾和嗜中性粒细胞 (Ly6G⁺) 特性 (图2)⁷。

最后,我们提出了一个方案,用于CyTOF分析处理新鲜的全骨髓。在本文中,我们以小鼠骨髓为例,而此协议也可用于处理人类骨髓样本。协议中也注明了人类骨髓样本的细节。该协议的优点是,它包含一些细节,如孵育时间和温度,经过优化,以保存整个骨髓中的嗜中性粒细胞,以便对完整的整个骨髓进行调查。对于荧光激活流式细胞学应用,此协议也可轻松修改。