Mirando hacia afuera: Aislamiento de polímeros y proteínas de carbohidratos liberados de cianobacteria
Summary
Aquí, se describen los protocolos para el aislamiento de polímeros de carbohidratos liberados por cianobacterias y el aislamiento de sus exoproteomes. Ambos procedimientos incorporan pasos clave para obtener polímeros o proteínas con grados de alta pureza que se pueden utilizar para análisis o aplicaciones adicionales. También se pueden adaptar fácilmente según las necesidades específicas del usuario.
Abstract
Las cianobacterias pueden secretar activamente una amplia gama de biomoléculas en el entorno extracelular, como los heteropolisacáridos y las proteínas. La identificación y caracterización de estas biomoléculas puede mejorar el conocimiento sobre sus vías de secreción y ayudar a manipularlas. Además, algunas de estas biomoléculas también son interesantes en términos de aplicaciones biotecnológicas. Aquí se describen dos protocolos para el aislamiento fácil y rápido de polímeros y proteínas de carbohidratos liberados por cianobacterias. El método de aislamiento de polímeros de carbohidratos liberados se basa en técnicas convencionales de precipitación de polisacáridos en soluciones acuosas utilizando disolventes orgánicos. Este método preserva las características del polímero y al mismo tiempo evita la presencia de contaminantes de los desechos celulares y el medio de cultivo. Al final del proceso, el polímero liofilizado está listo para ser utilizado o caracterizado o puede ser sometido a más rondas de purificación, dependiendo del uso final previsto. En cuanto al aislamiento del exoproteoma cianobacteriano, la técnica se basa en la concentración del medio libre de células después de la eliminación de los principales contaminantes por centrifugación y filtración. Esta estrategia permite un aislamiento fiable de las proteínas que alcanzan el medio extracelular a través de transportadores de membrana o vesículas de membrana externa. Estas proteínas se pueden identificar posteriormente utilizando técnicas estándar de espectrometría de masas. Los protocolos presentados aquí se pueden aplicar no sólo a una amplia gama de cianobacterias, sino también a otras cepas bacterianas. Además, estos procedimientos se pueden adaptar fácilmente según el uso final de los productos, el grado de pureza requerido y la cepa bacteriana.
Introduction
Las cianobacterias son ampliamente reconocidas como fuentes prolíficas de productos naturales con aplicaciones biotecnológicas/biomédicas prometedoras. Por lo tanto, la comprensión de los mecanismos de secreción cianobacteriana y la optimización de los métodos de extracción/recuperación son esenciales para implementar cianobacterias como fábricas de células microbianas eficientes.
Muchas cepas cianobacterianas son capaces de producir sustancias poliméricas extracelulares (EPS), formadas principalmente porheteropolisacáridos, que permanecen asociadas a la superficie celular o se liberan en el medio 1. Estos polímeros de carbohidratos liberados tienen características distintas en comparación con los de otras bacterias, que los hacen adecuados para una amplia gama de aplicaciones (por ejemplo, antivirales2, inmunoestimuladores3, antioxidante4, metal-quelating5, emulsionando6, y agentes de administración de drogas7,8). La metodología para el aislamiento de estos polímeros contribuye en gran medida no sólo a la mejora del rendimiento, sino también al aumento de la pureza y las propiedades físicas específicas del polímero obtenido9. La gran mayoría de estos métodos para el aislamiento de los polímeros se basan en estrategias de precipitación del medio de cultivo que se logran fácilmente debido a la fuerte naturaleza aniónica del polímero9,10. Además, la eliminación de los disolventes utilizados en el paso de precipitación se puede lograr rápidamente por evaporación y/o liofilización. Dependiendo de la aplicación prevista, se pueden acoplar diferentes pasos después o antes de la precipitación de polímeros para adaptar el producto final, que incluyen el tratamiento del ácido tricloroacético (TCA), filtración o cromatografía de exclusión de tamaño (SEC) purificación de columnas10.
Las cianobacterias también son capaces de secretar una amplia gama de proteínas a través de vías dependientes de transportadores de membrana (clásicos)11 o mediadas por vesículas (no clásicas)12. Por lo tanto, el análisis del exoproteome cianobacteriano constituye una herramienta esencial, tanto para entender/manipular los mecanismos de secreción de proteínas cianobacterianas como para comprender la función extracelular específica de estas proteínas. El aislamiento y análisis fiables de los exoproteomes requieren la concentración del entorno extracelular, ya que la abundancia de proteínas secretadas es relativamente baja. Además, otras etapas físicas o químicas (por ejemplo, centrifugación, filtración o precipitación proteica) pueden optimizar la calidad del exproteome obtenido, enriqueciendo el contenido proteico13y evitando la presencia de contaminantes (por ejemplo, pigmentos, carbohidratos, etc.) 14 , 15 o el predominio de proteínas intracelulares en las muestras. Sin embargo, algunos de estos pasos también pueden restringir el conjunto de proteínas que se pueden detectar, lo que conduce a un análisis sesgado.
Este trabajo describe protocolos eficientes para el aislamiento de polímeros de carbohidratos liberados y exoproteomes de medios de cultivo de cianobacterias. Estos protocolos se pueden adaptar fácilmente a los objetivos específicos del estudio y a las necesidades del usuario, manteniendo al mismo tiempo los pasos básicos que se presentan aquí.
Protocol
Representative Results
Discussion
Para comprender mejor los mecanismos de secreción bacteriana y estudiar los productos liberados, es de extrema importancia demostrar el aislamiento y análisis eficientes de las biomoléculas presentes en el entorno bacteriano extracelular (como polímeros de carbohidratos y proteínas).
Los polímeros de carbohidratos extracelulares cianobacterianos son extremadamente complejos, principalmente debido al número y proporción de diferentes monosacáridos que constituyen su composición<sup cl…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabajo fue financiado por los fondos de la Fundo Europeu de Desenvolvimento Regional (FEDER) a través del Programa DE Competitividad e Internacionalización (POCI) COMPETE 2020, Portugal 2020, y por fondos portugueses a través del FCT – Fundación para la Ciencia y el Programa De Lancia e A Tecnologia/Ministério da Ciéncia, Tecnologia e Ensino Superior en el marco del proyecto POCI-01-0145-FEDER-028779 y la subvención SFRH/BD/99715/2014 (CF).
Materials
| Dialysis membranes | Medicell Membranes Ltd | DTV.12000.07 | Visking Tubing Size 7, Dia 23.8 mm, Width 39-41 mm 30m Roll |
| Ethanol 96% | AGA – Álcool e Géneros Alimentares, S.A. | 4.000.02.02.00 | Fermentation ethyl alcohol 96% AGA |
| PES Filter 0.2 μm | Fisher Scientific, Lda | 15206869 | Syringe filter polystyrene 33MM 0.2µM STR |
| Amicon Ultra-15, Ultracel-3K | Merck Millipore Ltd. | UFC900324 | Centrifugal filters with a nominal molecular weight cut-off of 3 kDa |
| Thermo Scientific Pierce BCA Protein Assay | Fisher Scientific, Lda | 10741395 | Green-to-blue, precise, detergent-compatible assay reagent to measure total protein concentration |
| Brillant Blue G Colloidal Concentrate | Sigma Aldrich Química SL | B2025-1EA | Coomassie blue |
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