Determinación de la densidad del conducto biliar en el hígado del ratón

El árbol biliar es una parte crítica del hígado de mamífero, permitiendo el paso de la bilis de los hepatocitos al intestino. Los conductos biliares intrahepáticos (BD) están formados por colangiocitos, que se diferenciande los hepatoblastos bipotenciales a través de la señalización Notch y TGF 1^,2. La especificación adecuada y el compromiso de los colangiocitos y su ensamblaje en BDs maduros son críticos para el desarrollo del árbol biliar intrahepático. A medida que el hígado crece durante el desarrollo o después de la regeneración de órganos, el sistema biliar necesita desarrollarse a lo largo del hígado para asegurar el drenaje biliar adecuado. Además, una serie de enfermedades sindrómicas y no sindrómicas dan lugar a la escasez de LOS DE intrahepáticos³. Además, una serie de enfermedades hepáticas agudas y crónicas dan lugar a las llamadas reacciones ductulares en el hígado, que se definen como la presencia de un número significativo de células que expresan marcadores biliares pero no necesariamente surgen de células biliares o forma de patente BDs⁴. En el trastorno multisistema Síndrome de Alagille (ALGS), haploinsuficiencia del ligando Notch irregular1 (JAG1) resulta en mala formación de BD y colestasis^5,6. Nuestro laboratorio demostró recientemente que una línea de ratón heterocigoto Jag1 previamente generada⁷ es un modelo animal de la escasez BD en ALGS^8. En este modelo de ratón de ALGS, los colangiocitos todavía están presentes. Sin embargo, no se comprometen a incorporarse a los DE de patente^8. Por lo tanto, el análisis del hígado en un modelo de escasez de BD requiere más que la presencia aparente o ausencia de colangiocitos. Es importante evaluar con precisión el grado en que los BDmaduros están presentes en el hígado.

En patología anatómica, existen métodos cuantitativos aceptados para evaluar si la escasez de BD existe⁹. Por ejemplo, los estudios sobre ALGS en pacientes humanos a menudo cuantifican la relación BD a vena porta (PV) mediante el análisis de al menos 10 vasos de portal por biopsia hepática^9,10. El análisis de la forma y la presencia o ausencia general de LOS BD de patentes, combinados con la química sérica, pueden proporcionar información valiosa sobre el desarrollo de BD en ratones^11,12,13. Sin embargo, los ratones pueden perder un número significativo de BDs con sólo un aumento modesto en el nivel^debilirrubina sérica 8. En consecuencia, un método cuantitativo que evalúe el número de BD presentes por PV puede proporcionar una medida más directa del grado de escasez de BD en ratones. En un informe reciente, cuantificamos el número de BDs por PV en todos los lóbulos hepáticos y reportamos una disminución significativa en la relación BD a PV en Jag1+/– animales⁸. Durante el transcurso de nuestro análisis, nos dimos cuenta de que a pesar de la variación significativa en el grado de respuesta inflamatoria y reacciones ductulares, la relación BD a PV no muestra mucha variabilidad⁸. Además, la cuantificación de la relación BD a PV nos permitió demostrar que la eliminación de una copia del gen de la glicoseltransferasa Poglut1 en Jag1+/– los animales pueden mejorar significativamente su escasez de BD⁸. En un fondo Jag1+/+, la pérdida condicional de Poglut1 en las células musculares lisas vasculares da como resultado un aumento progresivo en el número de BD, que es modesto (20-30%) en P7 pero sehace prominente en adultos 8. Una vez más, esta técnica nos permitió mostrar que incluso en P7, el aumento de la densidad de BD en estos animales es estadísticamente significativo. Cabe destacar que el aumento de la densidad de BD en este genotipo a los cuatro meses de edad también se validó mediante el análisis de fundición de resina. ⁸ Estas observaciones y otros informes que midieron la densidad de BD en diferentes modelos de ratón ALGS^14,15 nos llevaron a incorporar este método en nuestra estrategia general para analizar defectos biliares en varios mutantes y ratones transgénicos.

Aquí, detallamos una técnica sencilla que se puede utilizar para examinar el grado de escasez de BD en modelos de ratón de enfermedad hepática (Figura1). En este método, la co-tinción con marcadores de colangiocitos cytoqueratina (CK) 8 y CK19 (en adelante CK de amplio espectro, wsCK) se utiliza para visualizar BDs y cholangiocitos no incorporados en el hígado del ratón. Se añade un anticuerpo contra la actina muscular alfa-suave (-SMA) a la tinción para etiquetar los vasos. El análisis sistemático de la relación BD a PV en una sección que cubre todos los lóbulos hepáticos garantiza que se analice un gran número de PV para cada genotipo. Dado que nuestro método se basa en la cuantificación de BDs y PV en imágenes 2D, no es adecuado para estudiar los efectos de una mutación dada en la estructura 3D del árbol biliar o la integridad de los pequeños conductos biliares. Sin embargo, proporciona una estrategia simple y objetiva para que los investigadores evalúen el desarrollo biliar en el ratón.