Determinando a densidade do ducto biliar no fígado do rato

A árvore biliar é uma parte crítica do fígado de mamíferos, permitindo a passagem da bile de hepatócitos para o intestino. Os ductos biliares intrahepáticos (BDS) são formados por colangiócitos, que se diferenciam dos hepatoblastos bipotenciais através da sinalização de entalhe e TGFβ^1,2. A especificação e o compromisso apropriados dos colangiócitos e de seu conjunto em BDS maduros são críticos para o desenvolvimento da árvore biliar intrahepatic. Como o fígado cresce durante o desenvolvimento ou após a regeneração de órgãos, o sistema biliar precisa se desenvolver ao longo do fígado para garantir a drenagem biliar adequada. Além disso, um número de doenças sindrômica e não-sindrômica resultam no escassez de BDS intrahepatic³. Além disso, uma série de doenças hepáticas agudas e crônicas dão origem às chamadas reações ductulares no fígado, que são definidas como a presença de um número significativo de células que expressam marcadores biliares, mas não necessariamente surgem de células biliares ou forma patente BDs⁴. Na síndrome de Alagille do transtorno multisistema (algs), a haploinsuficiência do entalhe ligante jagged1 (JAG1) resulta em má formação de BD e colestase^5,6. Nosso laboratório demonstrou recentemente que uma linha Jag1 heterozygous previamente gerada⁷ do rato é um modelo animal de BD escassez em algs⁸. Neste modelo do rato de algs, os colangiócitos estão ainda atuais. No entanto, eles não conseguem se comprometer com a incorporação em maduro, patentes BDs⁸. Conseqüentemente, a análise do fígado em um modelo de BD escassez exige mais do que a presença ou a ausência aparente de cholangiocytes. É importante avaliar com precisão o grau em que os BDs maduros estão presentes no fígado.

Na patologia anatômica, existem métodos quantitativos aceitos para avaliar se a BD escassez existe⁹. Por exemplo, estudos sobre algs em pacientes humanos frequentemente quantificam a razão BD para veia porta (PV) analisando pelo menos 10 vasos portais por biópsia hepática^9,10. A análise da forma e a presença ou ausência geral de BDS de patentes, combinadas com a química sérica, podem fornecer informações valiosas sobre o desenvolvimento de BD em camundongos^11,12,13. No entanto, os camundongos podem perder um número significativo de BDs com apenas um aumento modesto no nível de bilirrubina sérica⁸. Assim, um método quantitativo que avalia o número de BDS presentes por PV pode fornecer uma medida mais direta do grau de BD escassez em camundongos. Em um relatório recente, nós quantificamos o número de BDs por o picovolt através de todos os lóbulos do fígado e relatamos uma diminuição significativa na relação do BD ao picovolt em Jag1 +/- animais⁸. No decorrer de nossa análise, observamos que, apesar da significativa variação do grau de resposta inflamatória e das reações ductulares, a relação BD com PV não mostra muita variabilidade⁸. Além disso, a quantificação da relação BD para PV permitiu demonstrar que a remoção de uma cópia do gene glicosiltransferase Poglut1 em Jag1 +/– animais pode melhorar significativamente a sua BD escassez⁸. Em um fundo Jag1 +/+ , a perda condicional de Poglut1 em células musculares lisas vasculares resulta em um aumento progressivo nos números de BD, o que é modesto (20-30%) no P7, mas torna-se proeminente em adultos⁸. Mais uma vez, esta técnica permitiu-nos mostrar que, mesmo em P7, o aumento da densidade de BD nesses animais é estatisticamente significante. Da nota, a densidade aumentada do BD neste genótipo em quatro meses da idade foi validada com a análise do molde da resina também. ⁸ estas observações e outros relatórios que mediram a densidade do BD em modelos diferentes do rato de algs^14,15 alertaram-nos incorporar este método em nossa estratégia total para analisar defeitos biliares em vários mutantes e camundongos transgênicos.

Aqui, detalhamos uma técnica direta que pode ser usada para examinar o grau de BD escassez em modelos de camundongo de doença hepática (Figura 1). Neste método, a cocoloração com marcadores de colangiócitos citoqueratina (CK) 8 e CK19 (a seguir CK de largo espectro, wsCK) é usada para visualizar BDs e colangiócitos não incorporados no fígado do mouse. Um anticorpo de encontro ao actínio alfa-liso do músculo (αSMA) é adicionado à mancha para etiquetar embarcações. A análise sistemática da relação BD para PV em uma seção que abrange todos os lóbulos hepáticos assegura que um grande número de PVs seja analisado para cada genótipo. Como nosso método depende da quantificação de BDs e PVs em imagens 2D, não é adequado para estudar os efeitos de uma determinada mutação na estrutura 3D da árvore biliar ou a integridade das pequenas condutas biliares. Não obstante, fornece uma estratégia simples e objetiva para que os investigadores avaliem o desenvolvimento biliar no rato.