Bestimmung der Gallengangsdichte in der Mausleber
Summary
Wir präsentieren eine recht einfache und empfindliche Methode zur genauen Quantifizierung der Gallengangsdichte in der Mausleber. Diese Methode kann bei der Bestimmung der Auswirkungen von genetischen und ökologischen Modifikatoren und der Wirksamkeit potenzieller Therapien in Mausmodellen von Gallenerkrankungen helfen.
Abstract
Maus wird allgemein als Modellorganismus verwendet, um Gallenkrankheiten zu untersuchen. Um die Entwicklung und Funktion des Gallensystems zu bewerten, werden verschiedene Techniken verwendet, einschließlich Serumchemie, histologische Analyse und Immunostainierung für bestimmte Marker. Obwohl diese Techniken wichtige Informationen über das Gallensystem liefern können, stellen sie oft kein vollständiges Bild der Gallengang (BD) Entwicklungsfehler in der gesamten Leber dar. Dies ist zum Teil auf die robuste Fähigkeit der Mausleber zurückzuführen, die Galle auch bei Tieren mit erheblichen Beeinträchtigungen in der Gallenentwicklung zu entwässern. Hier stellen wir eine einfache Methode zur Berechnung der durchschnittlichen Anzahl von BDs vor, die jeder Portalvene (PV) zugeordnet sind, in Abschnitten, die alle Lappen mutierter/transgener Mäuse abdecken. Bei dieser Methode werden Lebern in einer stereotypen Weise montiert und geschnitten, um den Vergleich zwischen verschiedenen Genotypen und experimentellen Bedingungen zu erleichtern. BDs werden mittels Lichtmikroskopie von Cytokeratin-gefärbten Cholangiocyten identifiziert und dann gezählt und durch die Gesamtzahl der im Leberbereich vorhandenen PVs dividiert. Als Beispiel zeigen wir, wie diese Methode klar zwischen Wildtypmäusen und einem Mausmodell des Alagille-Syndroms unterscheiden kann. Die hier vorgestellte Methode kann keine Techniken ersetzen, die die dreidimensionale Struktur des Gallenbaums visualisieren. Es bietet jedoch eine einfache und direkte Möglichkeit, die BD-Entwicklung und den Grad der kanalulären Reaktionsbildung bei Mäusen quantitativ zu bewerten.
Introduction
Der Gallenbaum ist ein kritischer Teil der Säugetierleber, so dass der Durchgang der Galle von Hepatozyten in den Darm ermöglicht. Intrahepatische Gallengänge (BDs) werden durch Cholangiozyten gebildet, die sich von bipotenten Hepatoblasten durch Notch und TGF-Signalisierung1,2unterscheiden. Die richtige Spezifikation und Das Richtige Engagement von Cholangiocyten und deren Montage in ausgereifte BDs sind entscheidend für die Entwicklung des intrahepatischen Gallenbaums. Da die Leber während der Entwicklung oder bei der Organregeneration wächst, muss sich das Gallensystem entlang der Leber entwickeln, um eine ordnungsgemäße Gallendrainage zu gewährleisten. Darüber hinaus führen eine Reihe von syndromischen und nicht-syndromischen Erkrankungen zu einem Mangel an intrahepatischen BDs3. Darüber hinaus führen eine Reihe akuter und chronischer Lebererkrankungen zu sogenannten kanalulären Reaktionen in der Leber, die definiert sind als das Vorhandensein einer signifikanten Anzahl von Zellen, die Gallenmarker exprimieren, aber nicht notwendigerweise aus Gallenzellen oder Patent BDs4. Bei der Multisystem-Störung Alagille-Syndrom (ALGS), Haploinsuffizienz der Kerb Liganden gezackt1 (JAG1) führt zu schlechter BD-Bildung und Cholestase5,6. Unser Labor hat kürzlich gezeigt, dass eine zuvor generierte Jag1 heterozygote Mauslinie7 ein Tiermodell von BD-Mangel in ALGS8ist. In diesem Mausmodell von ALGS sind Cholangiozyten noch vorhanden. Sie verpflichten sich jedoch nicht zur Aufnahme in ausgereifte, patente BDs8. Daher erfordert die Analyse der Leber in einem Modell der BD-Knappheit mehr als das scheinbare Vorhandensein oder Fehlen von Cholangiocyten. Es ist wichtig, genau zu beurteilen, inwieweit reife BDs in der Leber vorhanden sind.
In der anatomischen Pathologie gibt es anerkannte quantitative Methoden zur Beurteilung, ob BD-Mangel existiert9. Zum Beispiel, Studien an ALGS bei menschlichen Patienten oft quantifizieren die BD zu Portal Vene (PV) Verhältnis durch die Analyse von mindestens 10 Portalgefäße pro Leberbiopsie9,10. Die Analyse der Form und des Gesamtvorhandenseins oder Fehlens von Patent-BDs, kombiniert mit Serumchemie, kann wertvolle Informationen über die BD-Entwicklung bei Mäusen11,12,13liefern. Jedoch, Mäuse können eine erhebliche Anzahl von BDs mit nur einem bescheidenen Anstieg des Serum Bilirubin-Spiegel8verlieren. Dementsprechend kann eine quantitative Methode, die die Anzahl der pro PV vorhandenen BDs bewertet, ein direkteres Maß für den Grad des BD-Mangels bei Mäusen liefern. In einem kürzlich veröffentlichten Bericht quantifizierten wir die Anzahl der BDs pro PV über alle Leberlappen hinweg und berichteten von einem signifikanten Rückgang des BD-PV-Verhältnisses bei Jag1+/– Tieren8. Im Laufe unserer Analyse stellten wir fest, dass trotz der signifikanten Variation des Grades der Entzündungsreaktion und der Kanalreaktionen das BD-PV-Verhältnis nicht viel Variabilitätaufweist 8. Darüber hinaus konnte die Quantifizierung des BD-PV-Verhältnisses nachweisen, dass das Entfernen einer Kopie des Glykosyltransferase-Gens Poglut1 in Jag1+/– Tiere ihren BD-Mangel deutlich verbessern kann8. In einem Jag1+/+ Hintergrund führt der bedingte Verlust von Poglut1 in vaskulären glatten Muskelzellen zu einem progressiven Anstieg der BD-Zahlen, der bescheiden ist (20-30%) bei P7, wird aber bei Erwachsenendeutlich 8. Auch diese Technik erlaubte es uns zu zeigen, dass selbst bei P7 die Zunahme der BD-Dichte bei diesen Tieren statistisch signifikant ist. Bemerkenswert ist, dass die erhöhte BD-Dichte in diesem Genotyp im Alter von vier Monaten auch durch Harzgussanalyse validiert wurde. 8 Diese Beobachtungen und andere Berichte, die die BD-Dichte in verschiedenen ALGS-Mausmodellen14,15 maßen, veranlassten uns, diese Methode in unsere Gesamtstrategie zur Analyse von Gallendefekten in verschiedenen Mutanten zu integrieren. und transgene Mäuse.
Hier beschreiben wir eine einfache Technik, die verwendet werden kann, um den Grad des BD-Mangels in Mausmodellen von Lebererkrankungen zu untersuchen (Abbildung 1). Bei dieser Methode wird die Co-Färbung mit den Cholangiozytenmarkern Cytokeratin (CK) 8 und CK19 (im Folgenden Wide-Spektrum CK, wsCK) verwendet, um BDs und ungekauzte Cholangiozyten in der Mausleber zu visualisieren. Ein Antikörper gegen alpha-glattes Muskelaktin wird der Färbung zur Kennzeichnung von Gefäßen hinzugefügt. Die systematische Analyse des BD-PV-Verhältnisses in einem Abschnitt, der alle Leberlappen abdeckt, stellt sicher, dass für jeden Genotyp eine große Anzahl von Pv-VVs analysiert wird. Da unsere Methode auf der Quantifizierung von BDs und PVs in 2D-Bildern beruht, ist sie nicht geeignet, die Auswirkungen einer gegebenen Mutation auf die 3D-Struktur des Gallenbaums oder die Integrität der kleinen Gallenschläuche zu untersuchen. Dennoch bietet es eine einfache und objektive Strategie für die Ermittler, die Gallenentwicklung in der Maus zu bewerten.
Protocol
Representative Results
Discussion
Die Analyse der BD-Entwicklung und -Reparatur bei Mäusen ist ein wichtiges Instrument zur Untersuchung der Pathogenese und des Mechanismus cholestatischer Erkrankungen. Darüber hinaus hängt die Entwicklung neuer Therapien zum Teil von der Etablierung eines reproduzierbaren und vorzugsweise quantifizierbaren Phänotyps ab. Aktuelle Phänotypisierung in Mausmodellen beinhaltet in der Regel Serumchemie, Leberhistologie und Immunostainierung für zelltypspezifische Marker. Obwohl diese Techniken wertvolle Informationen ü…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Die Autoren würdigen die Unterstützung der National Institutes of Health (NIH) (R01 GM084135 und R01 DK109982), einen Pilot/Feasibility Award des Texas Medical Center Digestive Disease Center unter NIH P30 DK56338 und einen Alagille Syndrome Accelerator Award von Die Medical Foundation.
Materials
| Isothesia (Isoflurane) | Henry Schein | 11695-6776-2 | |
| Desiccator | Bel-Art | 16-800-552 | |
| 10% PFA | Electron Microscopy Sciences | 15712 | |
| 50mL tube | ThermoScientific | 339653 | |
| 70% Ethanol | Decon Laboratories | 2401 | |
| 95% Ethanol | Decon Laboratories | 2801 | |
| 100% Ethanol | Decon Laboratories | 2701 | |
| HistoChoice | VWR Life Sciences | H103-4L | clearing agent |
| Omnisette Tissue Cassette | Fisher HealthCare | 15-197-710E | |
| Macrosette | Simport | M512 | |
| Paraplast X-TRA | McCormick Scientific | 39503002 | Parrafin |
| Tissue Mold | Fisher Scientific | 62528-32 | |
| Microtome | Microm | HM 325 | |
| Superfrost Plus Microscope Slides | Fisher Scientific | 12-550-15 | |
| Xylene | Fisher Scientific | C8H10 | |
| Tris-Based Antigen Retrieval | Vector Laboratories | H-3301 | |
| Pressure Cooker | Instant Pot | Lux Mini | |
| Mini Pap Pen | Life Technologies | 8877 | |
| Polyoxyethylene 20 Sorbitan Monolaurate (Tween-20) | J.T. Baker | X251-07 | |
| Octyl Phenol Ethoxylate (Triton-X-100) | J.T. Baker | X198-07 | |
| Normal Goat Serum | Jackson Immunoresearch | 005-000-121 | |
| anti-CK8 | Developmental Studies Hybridoma Bank | TROMA-I | Antibody Registry ID AB531826 |
| anti-CK19 | Developmental Studies Hybridoma Bank | TROMA-III | Antibody Registry ID AB2133570 |
| anti-αSMA | Sigma Aldrich | A2547, Clone 1A4 | |
| anti-rat-Alexa488 | ThermoFisher | A21208 | |
| anti-mouse-Cy5 | Jackson Immunoresearch | 715-175-151 | |
| DAPI | Vector Laboratories | H-1000 | |
| 22×50 micro cover glass | VWR Life Sciences | 48393 059 | |
| Fluorescence Microscope | Leica | DMI6000 B | |
| Kimwipes | Kimtech Science | 05511 | |
| VECTASHIELD | Vector Laboratories | H-1000 | Antifade Mounting Medium |
Referenzen
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