Détermination de la densité de duct biliaire dans le foie de souris

L’arbre biliaire est une partie critique du foie des mammifères, permettant le passage de la bile des hépatocytes dans l’intestin. Les canaux biliaires intrahépatiques (BD) sont formés par des cholangiocytes, qui se différencient des hépatoblastes bipotentiels par Notch et TGFMD signalant^1,2. La spécification et l’engagement appropriés des cholangiocytes et de leur assemblage dans les BD mûrs sont essentiels pour le développement de l’arbre biliaire intrahépatique. Comme le foie se développe pendant le développement ou lors de la régénération des organes, le système biliaire doit se développer le long du foie pour assurer un drainage biliaire approprié. En outre, un certain nombre de maladies syndromicmiques et non-syndromamiques ont comme conséquence le manque de BDs intrahépatiques^3. En outre, un certain nombre de maladies hépatiques aigues et chroniques donnent lieu à des réactions dites canalulaires dans le foie, qui sont définies comme la présence d’un nombre important de cellules qui expriment des marqueurs biliaires, mais ne proviennent pas nécessairement de cellules biliaires ou de la forme brevet BDs⁴. Dans le désordre multisystème syndrome d’Alagille (ALGS), haploinsufficiency de la ligand de Notch degged1 (JAG1) a comme conséquence la formation pauvre de BD et la cholestasis^5,6. Notre laboratoire a récemment démontré qu’une ligne de souris Heterozygous Jag1 déjà générée⁷ est un modèle animal de paucité BD dans ALGS⁸. Dans ce modèle de souris d’ALGS, les cholangiocytes sont toujours présents. Cependant, ils ne s’engagent pas à l’incorporation dans les BD de brevet mûrs⁸. Par conséquent, l’analyse du foie dans un modèle de manque de BD exige plus que la présence apparente ou l’absence des cholangiocytes. Il est important d’évaluer avec précision la mesure dans laquelle les BD matures sont présents dans le foie.

Dans la pathologie anatomique, il existe des méthodes quantitatives acceptées pour évaluer si le manque de BD existe⁹. Par exemple, les études sur l’ALGS chez les patients humains quantifient souvent le rapport BD à veine portail (PV) en analysant au moins 10 vaisseaux portailpar biopsie du foie^9,10. L’analyse de la forme et de la présence globale ou de l’absence de BD de brevet, combinée avec la chimie de sérum, peut fournir l’information valable au sujet du développement de BD chez les souris^11,12,13. Cependant, les souris peuvent perdre un nombre significatif de BD avec seulement une augmentation modeste du niveau^debilirubine de sérum 8. En conséquence, une méthode quantitative qui évalue le nombre de BD présents par PV peut fournir une mesure plus directe du degré de manque de BD chez les souris. Dans un rapport récent, nous avons quantifié le nombre de BD par PV sur tous les lobes dufoie et signalé une diminution significative du rapport BD/PV chez les animaux Jag1MD/8 . Au cours de notre analyse, nous avons remarqué que, malgré la variation significative du degré de réponse inflammatoire et des réactions ductulaires, le rapport BD/PV ne montre pas beaucoup de variabilité⁸. De plus, la quantification du ratio BD/PV nous a permis de démontrer que la suppression d’une copie du gène de glycosyltransferase Poglut1 chez les animaux Jag1MD/MD peut améliorer considérablement leur paucity BD⁸. Dans un contexte Jag1/ MD, la perte conditionnelle de Poglut1 dans les cellules musculaires lisses vasculaires entraîne une augmentation progressive du nombre de BD, qui est modeste (20-30%) à P7, mais devient important chez les adultes⁸. Encore une fois, cette technique nous a permis de montrer que même à P7, l’augmentation de la densité de BD chez ces animaux est statistiquement significative. Il convient de noter que l’augmentation de la densité de BD dans ce génotype à l’âge de quatre mois a été validée par l’analyse de fonte de résine aussi bien. ⁸ Ces observations et d’autres rapports qui ont mesuré la densité de BD dans différents modèles de souris d’ALGS^14,15 nous ont incités à incorporer cette méthode dans notre stratégie globale pour analyser des défauts biliaires dans divers mutants et les souris transgéniques.

Ici, nous détaillons une technique simple qui peut être utilisée pour examiner le degré de manque de BD dans les modèles murins de maladie du foie (Figure 1). Dans cette méthode, la co-coloration avec des marqueurs de cholangiocyte cytokatin (CK) 8 et CK19 (ci-après à large spectre CK, wsCK) est employée pour visualiser BDs et cholangiocytes non incorporés dans le foie de souris. Un anticorps contre l’actine musculaire alpha-lisse est ajouté à la coloration pour étiqueter les vaisseaux. L’analyse systématique du rapport BD/PV dans une section couvrant tous les lobes du foie garantit qu’un grand nombre de PV sont analysés pour chaque génotype. Étant donné que notre méthode repose sur la quantification des BD et des PV en images 2D, elle n’est pas adaptée pour étudier les effets d’une mutation donnée sur la structure 3D de l’arbre biliaire ou l’intégrité des petits conduits biliaires. Néanmoins, il fournit une stratégie simple et objective pour les chercheurs d’évaluer le développement biliaire chez la souris.