Isolement, culture, caractérisation et différenciation des cellules de l'ancêtre musculaire humain de la procédure de biopsie musculaire squelettique

Le muscle squelettique est le plus grand système d’organes dans le corps humain, représentant 30-40% de la masse corporelle entière¹. En plus de son rôle bien reconnu dans la locomotion, le muscle squelettique maintient la température et la posture du corps, et joue un rôle central dans l’homéostasie nutritive du corps entier. La recherche impliquant des participants humains, des animaux et des modèles de culture cellulaire est précieuse pour répondre aux questions relatives à la biologie et à la régénération des muscles squelettiques. L’isolement et la culture des cellules progénitrices musculaires primaires humaines (HMPC) fournit un modèle robuste qui permet d’appliquer des techniques de culture cellulaire et des manipulations sur des échantillons humains. Un avantage de l’utilisation de HMPCest est qu’ils conservent le phénotype génétique et métabolique de chaque donneur^2,3. Le maintien du phénotype du donneur permet aux chercheurs d’examiner la variation interindividuelle du processus myogénique. Par exemple, nous avons utilisé notre méthode de caractérisation du HMPC pour identifier les différences liées à l’âge et au sexe dans la capacité d’expansion de la population du CPMH⁴.

Le but de ce protocole est de détailler des techniques pour isoler, culture, caractériser, et différencier hMPCs du tissu de biopsie de muscle squelettique. S’appuyant sur des travaux antérieurs qui décrivicomment les HMPC et identifient les fabricants potentiels de surface cellulaire pour l’isolement du HMPC^5,6, ce protocole comble une lacune critique dans la connaissance en liant l’isolement à la caractérisation des HMPC. De plus, les instructions détaillées étape par étape incluses dans ce protocole rendent l’isolement et la caractérisation du HMPC accessibles à un large public scientifique, y compris ceux qui ont une expérience antérieure limitée avec les HMPC. Notre protocole est parmi les premiers à décrire l’utilisation d’un cytomètre d’imagerie pour suivre les populations cellulaires. Les cytomètres d’imagerie nouvellement conçus sont à la fine pointe de la technologie, à haut débit et à base de microplaques, ce qui permet l’imagerie cellulaire vivante, le comptage cellulaire et l’analyse de la fluorescence multicanal de toutes les cellules dans chaque puits d’un vaisseau culturel en quelques minutes. Ce système permet une quantification rapide des changements dynamiques dans la prolifération et la viabilité de toute une population cellulaire avec seulement une perturbation minimale de la culture. Par exemple, nous sommes en mesure d’effectuer des mesures objectives de la confluence sur les jours successifs in vitro pour déterminer la cinétique de croissance de chaque culture dérivée de différents donneurs. De nombreux protocoles dans la littérature, en particulier ceux impliquant la différenciation des MPC, exigent que les cellules atteignent un niveau défini de confluence avant d’initier la différenciation ou le traitement⁷. Notre méthode permet une détermination objective de la confluence de chaque puits dans un récipient de culture permettant aux chercheurs d’initier le traitement d’une manière impartiale et non subjective.

Dans le passé, une limitation majeure de l’utilisation des HMPC primaires était de faibles rendements qui limitent le nombre de cellules disponibles pour les expériences. Nous et d’autres avons montré que le rendement des MPC à partir du tissu de biopsie des muscles squelettiques est de 1 à 15 MPC par milligramme de tissu (Figure 1)⁸. Parce que notre protocole permet quatre passages des cellules avant la purification avec fluorescence activée tri des cellules (FACS), nos rendements de hMPC cryoconservés, dérivés de petites quantités de tissu de biopsie (50-100 mg), sont suffisants pour répondre aux objectifs de recherche où plusieurs expériences sont nécessaires. Notre protocole FACS produit une population MPC pure (Pax7 positive) de 80 %, de cette façon, notre protocole est optimisé pour le rendement et la pureté.