Silenciamento gênico mediado por Lentivirus em Pseudoislet humano preparado em placas de baixo acessório

A perda da massa beta funcional da pilha é a patologia central para o tipo-1 e o tipo-2 diabetes¹. Enquanto as células beta são os produtores de insulina em ilhotas pancreáticas, a comunicação entre as células beta e as células não beta desempenha um papel crítico na regulação da secreção de insulina². Além disso, a disregulação da secreção de glucagon contribui para a hiperglicemia no diabetes³. Assim, há um forte interesse em modular a expressão gênica de células dentro de ilhotas pancreáticas para abordar o mecanismo por trás do desenvolvimento da disfunção de ilhotas no diabetes. Uma variedade de aproximações que incluem ratos transgênicas está disponível para modular a expressão do gene de Islets do rato. Entretanto, as ilhotas humanas e do rato mostram a inervação distinta, a distribuição da pilha, a relação de beta às pilhas alfa, e a resposta aos secretagogos⁴. Portanto, a avaliação direta da função gênica em ilhotas humanas é extremamente importante para a compreensão da fisiopatologia das ilhotas pancreáticas humanas.

O vetor adenoviral é o vetor viral mais utilizado para transduce ilhotas pancreáticas in vitro devido à alta eficiência de transdução em células não-divisoras. No entanto, o adenovírus não penetra no núcleo das ilhotas de forma eficiente, especialmente nas ilhotas humanas⁵, e é citotóxica em altas doses⁶. Comparativamente, o vetor lentivirais é menos citotóxica e entrega genes exógenos permanentemente no cromossoma de pilhas borne-mitotic, fazendo lhe um veículo extensamente testado para a terapia do gene⁷. Entretanto, a capacidade do Lentivirus de penetrar o núcleo de ilhotas humanas intactas é limitada igualmente, assim exigindo a dispersão parcial pela digestão enzimática para aumentar a eficiência da transdução⁸. A ressalva com a dispersão de ilhotas humanas intactas é a interrupção da comunicação célula-célula e célula-matriz, que compromete a regulação dinâmica da secreção de insulina crítica para a manutenção da homeostase da glicose em seres humanos⁹. Assim, tem sido desafiador avaliar o impacto da modulação gênica na regulação dinâmica da função de ilhotas em um modelo de Ilhéus humanos.

Soube-se que as pilhas dispersadas do Islet das ilhotas humanas e do roedor reagregam autonomamente em Islet-como as estruturas chamadas “pseudoislets”. Pseudoislets mostra a distribuição beta e non-beta da pilha similar às ilhotas nativas^10,11. Adicionalmente, após a cultura a longo prazo, as ilhotas nativas perdem progressivamente a secreção robusta de insulina de primeira fase^5,10,11,12. No entanto, as pseudoilhotas demonstraram melhor preservação da secreção de insulina de primeira fase em resposta à glicose em comparação com as ilhotas nativas após o mesmo período de cultura⁵. Além de ter melhor preservação da secreção de insulina, a reagregação controlada por tamanho de células de Illet humanas em placas de fixação baixas¹¹ fornece uma janela de oportunidade para introduzir vetores de Lentivirus antes de sua reagregação em pseudoislets. Diversos estudos demonstraram a utilidade dos pseudoislets combinados com o transdução mediada lentivirais. Caton et al.¹³ relataram que a introdução da proteína verde fluorescente (GFP) expressando Lentivirus teve pouco efeito sobre a secreção de insulina, obtendo expressão homogênea de GFP em pseudoislets de ratos em comparação com o controle não infectado. Eles também demonstraram o efeito específico de diferentes connexinas na secreção de insulina por sobreexpressar as connexinas 32, 36 e 43 via Lentivirus¹³. Os pseudoislets humanos preparados com uma placa de acessório ultra-baixa disponível comercialmente de 96-well demonstraram que o superexpressão lentiviral-negociado do fator SIX3 da transcrição melhora o secretion da insulina avaliado pela incubação estática¹⁴. Recentemente, os pseudoislets humanos preparados com uma placa ultra-baixa do acessório 96-well foram usados para downregulam o glucokinase através do RNA curto lentivirais do hairpin (shRNA) como uma prova do princípio para mostrar que a secreção glucose-estimulada do insulin é reduzida, quando A secreção de insulina estimulada por KCl foi preservada⁵. O estudo igualmente demonstrou que os pseudoislets humanos são similares às ilhotas nativas na expressão de gene e nos perfis secretora, suportando mais a utilidade de pseudoislets humanos para dissecar a regulação da função de ilhotas⁵. Embora o perifusion não fosse executado, uma placa geneticamente modificados da cultura do de micropoços que se tornasse recentemente disponível comercialmente, foi relatada igualmente para ser compatível para o transdução lentivirais e produziu os pseudoislets humanos que exibiram a insulina excelente secreção in vitro e in vivo após o transplante¹¹. Coletivamente, a formação de pseudoislet humana combinada com a transdução lentivirais é uma abordagem simples e eficiente para investigar a fisiopatologia da ilhotas humana, proporcionando uma valiosa ferramenta para realizar estudos mecanísticos em ilhotas humanas.

No relatório atual, um protocolo para dar forma a pseudoislets humanos transou com o Lentivirus usando duas plataformas comercialmente disponíveis, uma placa ultra-baixa do acessório 96-well e uma placa da cultura do de micropoços são apresentadas. Ambos conseguem a modulação eficiente da expressão gênica e criam pseudoislets humanos que são compatíveis para avaliações a jusante, incluindo incubação estática e perifusão.