Lentivirale gemedieerde gen-uitschakeling in humaan pseudo-eilandje bereid in lage bevestigings platen

Het verlies van functionele bèta celmassa is de centrale pathologie voor zowel type 1 als type 2 diabetes¹. Terwijl beta-cellen zijn de producenten van insuline in alvleesklier eilandjes, communicatie tussen bètacellen en niet-bètacellen speelt een cruciale rol in de regulering van insuline secretie². Bovendien, disregulatie van glucagonsecretie draagt bij aan hyperglycemie bij diabetes³. Er is dus sterke belangstelling om genexpressie van cellen binnen pancreas eilandjes te moduleren om het mechanisme achter de ontwikkeling van een eilandje dysfunctie bij diabetes aan te pakken. Een verscheidenheid aan benaderingen, waaronder transgene muizen, zijn beschikbaar om genexpressie van muis eilandjes te moduleren. Echter, menselijke en muis eilandjes vertonen verschillende innervatie, celverdeling, ratio van bèta aan Alfa cellen, en reactie op secretagogues⁴. Daarom is directe beoordeling van de genfunctie in menselijke eilandjes uitermate belangrijk voor het begrijpen van de pathofysiologie van de menselijke pancreas eilandjes.

Adenovirale vector is de meest gebruikte virale vector om pancreas eilandjes in vitro te leiden door de hoge efficiëntie van transductie in niet-scheidings cellen. Echter, adenovirus dringt niet naar de kern van de eilandjes efficiënt, vooral bij menselijke eilandjes⁵, en is cytotoxisch bij hoge doses⁶. Relatief is lentivirale vector minder cytotoxisch en levert het exogene genen permanent in het chromosoom van post-mitotische cellen, waardoor het een algemeen getest voertuig is voor gentherapie⁷. Het vermogen van het lentivirus om de kern van intacte menselijke eilandjes binnen te dringen is echter ook beperkt, waardoor gedeeltelijke dispersie door enzymatische spijsvertering nodig is om de transductie-efficiëntie⁸te verhogen. Het voorbehoud met de dispersie van intact menselijke eilandjes is de onderbreking van cel-cel en cel-matrix communicatie, die de dynamische regulering van insuline secretie kritisch voor het onderhoud van glucose homeostase bij de mens⁹compromitteert. Het is dus een uitdaging geweest om de impact van genmodulatie op de dynamische regulering van de eilandje-functie in een model van menselijke eilandjes te beoordelen.

Het is bekend dat verspreide eilandjes cellen van menselijke en knaagdieren autonoom reaggregate in eilandachtige structuren genaamd “pseudoislets”. Pseudoislets tonen bèta-en niet-bèta-celverdeling vergelijkbaar met inheemse eilandjes^10,11. Bovendien, na lange termijn cultuur, inheemse eilandjes geleidelijk verliezen robuuste eerste fase insuline secretie^5,10,11,12. Toch toonden pseudo-eilandjes een beter behoud van de eerste fase insuline secretie in reactie op glucose in vergelijking met inheemse eilandjes na dezelfde cultuur periode⁵. Naast het hebben van een beter behoud van insuline secretie, maat gecontroleerde reaggregation van menselijke eilandje cellen in lage bijlage platen¹¹ biedt een venster van de mogelijkheid om lentivirus vectoren voorafgaand aan hun reaggregation in te voeren pseudo-eilandjes. Verschillende studies hebben aangetoond dat het nut van pseudoislets gecombineerd met lentivirale gemedieerde transductie. Caton et al.¹³ meldde dat de introductie van het groene fluorescerende eiwit (GFP) dat lentivirus uitdrukt, weinig effect had op de insuline secretie, terwijl het een homogene expressie van GFP in rat pseudoislets in vergelijking met niet-geïnfecteerde controle had bereikt. Ze toonden ook het specifieke effect van verschillende connexinen op de insuline secretie door het overdrukken van connexinen 32, 36 en 43 via lentivirus¹³. Menselijke pseudo-eilandjes bereid met een in de handel verkrijgbare 96-well Ultra-Low-bevestigingsplaat toonden aan dat lentivirale gemedieerde overexpressie van transcriptiefactor SIX3 de insuline secretie verbetert die wordt beoordeeld door een statische incubatie¹⁴. Onlangs, menselijke pseudoislets bereid met een 96-goed ultra-lage bevestigingsplaat werden gebruikt om te downreguleren glucokinase via lentivirale korte haarspeld RNA (shRNA) als een bewijs van principe om te laten zien dat glucose-gestimuleerd insuline secretie wordt verlaagd, terwijl KCl-gestimuleerd insuline secretie werd bewaard⁵. De studie toonde ook aan dat menselijke pseudoislets vergelijkbaar zijn met inheemse eilandjes in genexpressie en secretoire profielen, waardoor het nut van menselijke pseudoislets om de regulering van de eilandje functie⁵te ontleden, verder wordt ondersteund. Hoewel de perifusie niet werd uitgevoerd, werd een biotechnologische micro well cultuur plaat die recentelijk commercieel beschikbaar werd, ook gerapporteerd als verenigbaar voor linvirale transductie en produceerde menselijke pseudoislets die uitstekende insuline vertoonden uitscheiding in vitro en in vivo na transplantatie¹¹. Collectief, menselijke pseudo-eiland vorming gecombineerd met lentivirale transductie is een eenvoudige en efficiënte benadering om de pathofysiologie van het menselijk eilandje te onderzoeken, wat een waardevol hulpmiddel is om mechanistische studies in menselijke eilandjes uit te voeren.

In het huidige rapport wordt een protocol opgesteld om menselijke pseudoislets te vormen, met lentivirus met behulp van twee in de handel verkrijgbare platformen, een 96-well Ultra-Low-bevestigingsplaat en een micro well-kweek plaat. Beide bereiken een efficiënte modulatie van genexpressie en creëren menselijke pseudoislets die verenigbaar zijn voor downstreambeoordelingen, waaronder statische incubatie en perifusie.