Lokalisierung von SUMO-modifizierten Proteinen mit fluoreszierenden Sumo-Fallen Proteinen
Summary
SUMO ist ein essentielles und hoch konserviertes, kleines, ubiquitin-ähnliches Modifikatorprotein. In diesem Protokoll beschreiben wir die Verwendung eines stresstoleranten rekombinanten, rekombinanten SUMO-Fantifen-Proteins (kmUTAG) zur Visualisierung von nativen, nicht markierten SUMO-Konjugaten und deren Lokalisierung in einer Vielzahl von Zelltypen.
Abstract
Hier stellen wir eine neuartige Methode vor, um die Sumoylierung von Proteinen und ihre subzelluläre Lokalisierung in Säugetierzellen und Nematoden-Eizellen zu untersuchen. Bei dieser Methode wird ein rekombinant modifiziertes SUMO-Fangscheiben-Protein-Fragment, kmUTAG, verwendet, abgeleitet von der Ulp1 SUMO Protease der stresstoleranten angehenden Hefe Kluyveromyces marxianus. Wir haben die Eigenschaften der kmUTAG angepasst, um Sumoylierung in einer Vielzahl von Modellsystemen ohne Antikörper zu studieren. Für die Studie von SUMO hat die KmUTAG im Vergleich zu Antikörper-basierten Ansätzen mehrere Vorteile. Dieses stresstolerante SUMO-Fallreagenz wird rekombinant produziert, es erkennt einheimische SUMO-Isoformen von vielen Arten, und im Gegensatz zu kommerziell erhältlichen Antikörpern zeigt es eine reduzierte Affinität für freie, unkonjugierte SUMO. Zu den repräsentativen Ergebnissen, die hier gezeigt werden, gehören die Lokalisierung von SUMO-Konjugaten in Säugegewebekulturzellen und Nematoden-Oozyten.
Introduction
Ziel dieser Methode ist es, die Erforschung und Analyse von SUMO-konjugierten Proteinen mit dem rekombinanten SUMO-Fallen UTAG (Ulp domainTag) Protein zu erleichtern. Wie im Folgenden beschrieben, kann die UTAG anstelle anderer Reagenzien und Ansätze zur Reinigung, Erkennung und Visualisierung von SUMO-modifizierten Proteinen eingesetzt werden. Je nach Wachstumsbedingungen können Zellen hunderte oder Tausende von Proteinen enthalten, die mit SUMO oder SUMO-Ketten modifiziert werden (siehe Kerscher et al. 20061 und Kerscher 20162). Dies stellt eine erhebliche Schwierigkeit für die funktionelle Analyse bestimmter SUMO-modifizierter Proteine dar, zumal nur ein Bruchteil eines bestimmten Sumoylierungsziels tatsächlich verändertwird 3. Zusätzlich zu ihren Rollen in wesentlichen zellulären Prozessen wie Transkription Regulierung, Protein-Haffinase, die Reaktion auf Zellstress und Chromatinumbau bei Mitose und Meiose; Inzwischen ist hinreichend klar geworden, dass SUMO, SUMO-modifizierte Proteine und SUMO-Pfadkomponenten auch als Biomarker für Pathologien wie Krebs und neurodegenerative Erkrankungen 4, 5,6 Potenzial haben. ,7. Dies unterstreicht die Notwendigkeit robuster, zuverlässiger und leicht verfügbarer Werkzeuge und innovativer Ansätze zur Erkennung und funktionellen Analyse von SUMO-modifizierten Proteinen in einer Vielzahl von Zellen und Proben.
In vielen Systemen sind SUMO-spezifische Antikörper die Reagenzien der Wahl für die Erkennung, Isolierung und funktionelle Analyse von SUMO-modifizierten Proteinen 8,9. Einige kommerziell erhältliche SUMO-spezifische Antikörper sind jedoch teuer, in der Menge oder Verfügbarkeit begrenzt, neigen dazu, völlig variable Affinitäten und Querreaktivität zu zeigen, und in einigen Fällen fehlt esan Reproduzierbarkeit 10. Ein alternativer Ansatz ist der Ausdruck von epitop getaggten SUMO in transformierten Zellen und Organismen, aber die Verknüpfung von Eitop-Tags mit SUMOkannseine Konjugation mit Proteinzielen 11 künstlich verringern. Außerdem sind Epitope nicht sinnvoll, wenn unveränderte Zellen oder Gewebe ausgewertet werden.
Ulp1 ist eine konservierte SUMO-Protease von S. cerevisiae , die sowohl den SUMO-Vorläufer als auch die Desumoylate von SUMO-konjugierten Proteinen 12 verarbeitet. Auf der Grundlage der serviösen Beobachtung, dass eine Mutation des katalytischen Cysteine (C580S) in der SUMO-Verarbeitung von Ulp1 nicht nur die SUMO-Kalkung verhindert, sondern auch SUMO-konjugierte Proteine mit hohem Avidität12. Aus Gründen der Einfachheit haben wir dieses Carbox-Terminal SUMO-Fallen Ulp1-C580S) als UTAG (kurz für UD TAG) bezeichnet. Die UTAG ist ein rekombinantes Pan-SUMO-Fangrettiein, das eine nützliche Alternative zu Anti-SUMO-Antikörpern darstellt, die zur Isolierung und Erkennung von SUMO-modifizierten Proteinen verwendet werden. Wichtig ist, dass es speziell einnehmend gefaltete, konjugierte SUMO erkennt und nicht nur ein oder mehrere Epitope auf SUMO. Um sowohl die Proteinstabilität als auch die SUKO-Bindungsfestigkeit der UTAG zu verbessern, haben wir aus der stresstoleranten Hefe Kluyveromyces marxianus (Km) eine Variante der UTAG entwickelt. KmUTAG bindet SUMO-konjugate eng mit Nanomolaraffinität13. Darüber hinaus ist kmUTAG gegen erhöhte Temperaturen (42 ° C) beständig, Reduktion von Wirkstoffen (5 mM TCEP-Tris-2-Carboxyethyl) Phosphin-Hydrochlorid), Denaturanten (bis zu 2 M Urea), Oxidationsmittel (0,6% Wasserstoffperoxid) und nicht-ionische Reinigungsmittel. Diese Stresstoleranz ist bei rauen Reinigungsbedingungen und längeren Inkubationszeiten vorteilhaft, um ihre Stabilität und SUMO-Fangtätigkeit zu gewährleisten. Es überrascht jedoch nicht, dass die SUMO-Fanging-Aktivität von KmUTAG mit zysteinmodifizierenden Reagenzien, ionischen Reinigungsmitteln und vollständig denaturierten Proteinextrakten unvereinbar ist. Die bemerkenswerte Affinität und Eigenschaften der KmUTAG deuten darauf hin, dass dieses Reagenz zum Standard-Repertoire für die Erforschung von sumoylierten Proteinen in mehreren Arten werden kann.
Hier bieten wir eine einfache Methode an, um SUMO-modifizierte Proteine in Säugetierzellen und Nematoden mit einem rekombinanten Fluoreszenz-MCherry-KmUTAG-Fusionsprotein (kmUTAG-fl) zu erkennen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Hier stellen wir die Verwendung von kmUTAG-fl, einem rekombinanten Protein, für funktionelle Studien von SUMO in festen Säugetierzellen und zerlegter Nematoden-Gonaden vor. KmUTAG-fl ist ein stresstolerantes Pan-SUMO-spezifisches Reagenz, das einheimische SUMO-konjugierte Proteine und SUMO-Ketten erkennt und eingefangen. Da die tertiäre Struktur von SUMO stark konserviert ist, ist es sehr wahrscheinlich, dass SUMO-Varianten aus zusätzlichen Modell-und Nicht-Modellsystemen mit dem kmUTAG-fl-Reagenz analysiert werden k…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wir bedanken uns bei allen Mitgliedern des Kerscher-Labors für die Unterstützung, Nathalie Nguyen für die kritische Lektüre des Manuskripts und Lidia Epp für die Sequenzierung. Diese Arbeit wurde vom Commonwealth Research Commercialization Fund MF16-034-LS an OK unterstützt. Die Forschungsförderung für W & M-Studierende erfolgte durch den Bailey-Huston Research Fund und die Charles Center Honors Fellowships an RY und CH.
Materials
| 16% Paraformaldehyde (formaldehyde) aqueous solution | Electron Microscopy Sciences | 30525-89-4 | |
| 6-Well Cell Culture Plates | Genesee Scientific/Olympus Plastics | 25-105 | |
| Alexa Fluor 488 AffiniPure Goat Anti-Mouse IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch | 115-545-003 | Used as a secondary antibody for mouse monoclonal antibody |
| DPBS, no calcium, no magnesium | Fisher Scientific | Gibco 14190144 | |
| Dylight 488 conjugated AffiniPure Goat Anti-Moue IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch | 115-485-146 | Used as a secondary antibody for mouse monoclonal antibody |
| Fisherbrand Coverglass for Growth Cover Glasses | Fisherbrand | 12545101 | |
| FLUORO-GEL II with DAPI | Electron Microscopy Sciences | 50-246-93) | Mounting media in step 1.11 |
| FLUORO-GEL with DABCO | Electron Microscopy Sciences | 17985-02 | With DAPI added to 1 µg/mL; mounting media in step 2.2.5 |
| Glycine-HCl | Fisher BioReagents | BP3815 | |
| Glycine-HCl | ACROS Organics | 6000-43-7 | |
| KmUTAG-fl | Kerafast | KmUTAG reagents are available on Kerafast.com | |
| Oneblock Western-CL blocking buffer | Prometheus | 20-313 | |
| PBS, Phosphate Buffered Saline, 10X Solution | Fisher BioReagents | BP3994 | |
| PNT2 cell line | Sigma-Aldrich | 95012613 | Normal prostate epithelium immortalized with SV40. |
| pSPOT1 | (ChromoTek GmbH) | ev-1 | https://www.chromotek.com/fileadmin/user_upload/pdfs/Datasheets/pSpot1_v1.pdf |
| SUMO 6F2 | DSHB | SUMO 6F2 | SUMO 6F2 was deposited to the DSHB by Pelisch, F. / Hay, R.T. (DSHB Hybridoma Product SUMO 6F2) |
| SUMO protease buffer [10x] | 500 mM Tris-HCl, pH 8.0, 2% NP-40, 1.5 M NaCl | ||
| SUMO-2 Antibody 8A2 | DSHB | SUMO-2 8A2 | SUMO-2 8A2 was deposited to the DSHB by Matunis, M. (DSHB Hybridoma Product SUMO-2 8A2) |
| TCEP-HCL | GoldBio | 51805-45-9 | Used as a reducing agent at a concentration of 5mM |
| Triton X-100 | Fisher BioReagents | 9002-93-1 | Used for permeablization at 0.1% in DPBS/PBS(for worms) |
Referenzen
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