Extraction de métabolites aqueux de cellules adhérentes cultivées pour analyse métabolomique par électrophorèse capillaire-spectrométrie de masse

1. culture cellulaire au jour 1 Note: chaque échantillon d’extraction de métabolite doit être préparé à partir d’un seul plat de culture tissulaire de 100 mm qui est modérément mais pas entièrement anastomosé (contenant approximativement 2 à 5 millions de cellules). Calculez le nombre de plats nécessaires au dosage et préparez-les en conséquence. Culture HCC827 et PC-9 cellules dans 5% CO2 à 37 ° c dans le milieu RPMI-1640 complété par 10% de sérum bovin FŒTAL (FBS). Aspirer les milieux de culture cellulaire des plats de culture de 100 mm. Laver les cellules de chaque plat à l’aide de 2 mL de solution saline tamponnée au phosphate (PBS) sans calcium ni magnésium. Agiter délicatement chaque plat de sorte que la solution PBS recouvre complètement la surface du plat. Aspirer le tampon de lavage des plats de culture. Réchauffer 0,25% de solution de trypsine-EDTA à 37 ° c et ajouter 2 mL de solution de trypsine-EDTA avec une pipette sérologique de 5 mL. Roche doucement chaque plat de sorte que la trypsine recouvre complètement la surface du plat. Incuber les plats de culture à 37 ° c pendant environ 5 min. Ajouter 4 mL de milieu de croissance complet préchauffé par plat. Resuspendre les cellules en milieu par pipetage en douceur plusieurs fois. Transférer chaque suspension cellulaire dans un tube conique de 15 mL séparé et centrifuger à 800 × g pendant 5 min. Resuspendre chaque culot de cellule dans 2 mL de milieu de croissance complet préchauffé. Déterminez le nombre total et la viabilité en pourcentage des cellules à l’aide du compteur de cellules automatisé et de la solution bleue 0,4% trypan. Mélanger 10 μL de suspension cellulaire et 10 μL de solution de bleu trypan de 0,4%. Chargez 10 μL d’échantillon dans la chambre de comptage de cellules par action capillaire. Insérez la glissière de la chambre dans le compteur de cellules automatisé. La lumière transmise s’allume automatiquement et l’instrument auto se concentre sur la cellule. Appuyez sur le bouton capture pour capturer l’image et afficher les résultats. Si nécessaire, ajouter un autre milieu de croissance pour obtenir la concentration de cellules désirée. Semences d’environ 1 à 2,5 millions de cellules par plat de culture cellulaire de 100 mm.Remarque: les concentrations de métabolite déterminées par l’analyse CE-MS seront normalisées en fonction du nombre de cellules viables. Aux fins du comptage de cellules, il est nécessaire de préparer au moins un plat de culture à ensemencement supplémentaire pour chaque groupe. Incuber les plats de culture dans 5% CO2 à 37 ° c pendant 18 h. 2. préparation des réactifs Diluer une solution étalon interne commerciale incluant la L-méthionine sulfone et l’acide d-camphre-10-sulfonique 1000 dans de l’eau ultrapure.NOTE: pour moins de 80 échantillons, mélanger simplement 50 μL de la solution étalon interne 1 et 45 mL d’eau ultrapure dans une fiole jaugée de 50 mL, puis apporter la solution jusqu’à 50 mL avec de l’eau ultrapure. Préparer une solution de mannitol de 0,05 g/mL dans de l’eau ultrapure comme tampon de lavage.Remarque: pour moins de 30 échantillons, dissoudre simplement 25 g de mannitol dans 500 mL d’eau ultrapure. Il faut environ 15 mL de tampon de lavage par plat de culture de 100 mm, afin de préparer un volume suffisant de tampon de lavage en fonction du nombre d’échantillons. 3. prélavage des unités de filtration centrifuge Pipetter 250 μL d’eau ultrapure dans la cuvette filtrante de chaque unité de filtration centrifuge (voir le tableau des matériaux).Remarque: deux unités filtrantes par échantillon sont requises. Visser hermétiquement les unités filtrantes et centrifuger à 9 100 × g à 4 ° c pendant 5 min. Vérifier le volume de chaque filtrat — si un filtrat significatif s’est accumulé pendant la première rotation courte, l’unité filtrante peut être défectueuse. Dans ce cas, jetez l’unité de filtration et utilisez une nouvelle unité de filtrage à la place. Fermez fermement les couvercles des unités filtrantes et Centrifugez à nouveau à 9 100 × g à 4 ° c pendant 30 min. S’assurer qu’aucune eau ultrapure ne reste dans l’une des tasses filtrantes; enlever l’eau ultrapure filtrée dans chaque tube collecteur avec une pipette et la jeter.Remarque: n’essayez pas d’enlever l’eau résiduelle dans une cuvette de filtre avec une pipette car elle pourrait endommager le filtre. Remplacez les tasses filtrantes dans leurs tubes de prélèvement.Remarque: utilisez les filtres centrifuges en moins d’une heure, car ils risquent d’être endommagés lors du séchage. 4. culture cellulaire au jour 2 Sortez les plats de culture de 100 mm de l’incubateur.Remarque: la durée de culture de la cellule recommandée est de 18 h. Aspirer le milieu de culture cellulaire de chaque plat de culture de 100 mm. Ajouter 10 mL de milieu de culture cellulaire qui comprend les concentrations appropriées de composés ou de médicaments à chaque plat, en prenant soin de ne pas déranger la couche cellulaire.Remarque: à des fins de démonstration, nous avons ajouté 10 μL de diamure de 250 mM dissous dans le PBS (concentration finale de 250 μM) dans cette expérience. Incuber les plats de culture à 37 ° c pendant 30 min en présence de diamide ou de PBS comme contrôle. Aspirer le milieu de culture cellulaire de chaque plat de culture de 100 mm. Lavez les cellules en ajoutant doucement 2 mL de solution de mannitol à 5% au bord de chaque plat, en prenant soin de ne pas déranger la couche cellulaire, puis inclinez légèrement le plat.Remarque: le PBS ou la solution saline interfère avec l’analyse métabolomique basée sur le CE-MS et affecte négativement les résultats de mesure, et ne doit donc pas être utilisé comme tampon de lavage. Aspirer le tampon de lavage de chaque plat de culture, puis laver les cellules à nouveau en ajoutant doucement 10 mL de tampon de lavage par plat et en inclinant légèrement le plat. Aspirer complètement le tampon de lavage du bord de chaque plat de culture.NOTE: aspirer autant de tampon de lavage que possible, tout en prêtant attention à ne pas aspirer les cellules. Le mannitol résiduel peut interférer avec l’analyse CE-MS; l’aspiration des cellules diminuera le nombre de cellules et deviendra ainsi une source d’erreur dans la normalisation des données. 5. extraction des métabolites des cellules cultivées Ajouter 800 μL de 99,7% de méthanol par plat de culture. Roche doucement chaque plat de culture d’avant en arrière pour couvrir toute sa surface. Laisser la vaisselle à température ambiante pendant 30 s. Ajouter lentement 550 μL de la solution étalon interne diluée par plat en immergeant la pointe de la pipette dans le méthanol et en le pipetant doucement plusieurs fois. Roche doucement chaque plat de culture d’avant en arrière pour couvrir toute sa surface. Laisser la vaisselle à température ambiante pendant 30 s. 6. ultrafiltration des extraits cellulaires Transférer la solution extraite de chaque plat de culture à un tube de microcentrifugation de 1,5 mL séparé. Centrifuger les tubes à 2 300 × g à 4 ° c pendant 5 min. Transférer 350 μL de chaque surnageant dans deux unités filtrantes centrifuges par échantillon.NOTE: à partir de chaque plat de culture, un total de 700 μL de la solution extraite est transféré dans deux tubes filtrants (350 μL/tube). Centrifuger les tubes filtrants à 9 100 × g à 4 ° c pendant environ 2 h jusqu’à ce qu’aucun liquide ne reste dans les tasses filtrantes. Retirez les tasses filtrantes et Fermez hermétiquement les couvercles des tubes de prélèvement. 7. évaporation de l’échantillon Préparez un évaporateur centrifuge — typiquement, il s’agit d’un évaporateur, d’un piège à froid et d’une pompe à vide. Placer les tubes de prélèvement dans l’évaporateur centrifuge.Remarque: laissez les couvercles des tubes ouverts. Évaporez les solutions d’échantillonnage extraites dans des conditions de vide à température ambiante.NOTE: les configurations typiques pour le nombre de rotations et la pression sont 1 500 RPM et 1 000 PA, respectivement, et il faut généralement environ 3 h pour évince complètement les échantillons. Vérifiez qu’aucun liquide ne reste dans l’un des tubes de prélèvement et fermez fermement les couvercles des tubes. Conserver les tubes de prélèvement dans un congélateur profond à température ultra basse (− 80 ° c) jusqu’à l’analyse métabolomique. 8. analyse métabolomique par CE-MS Resuspendre le filtrat dans 50 μL d’eau ultrapure immédiatement avant l’analyse CE-MS. Effectuer l’analyse ce-ms par des méthodes décrites précédemment12,13 utilisant le système d’électrophorèse capillaire et le système de spectromètre de masse de temps de vol équipé d’une pompe isocratique, d’un adaptateur ce-ms, et d’un pulvérisateur ce-ESI-MS.Remarque: les deux systèmes peuvent être contrôlés par le logiciel des vendeurs du système et sont reliés par un capillaire en silice fondue (50 μM de diamètre interne × 80 cm de longueur totale). Mettre en place des instruments et des flacons d’échantillon, préparer le capillaire avec une cassette capillaire, reconstituer les liquides de gaine et les tampons d’électrophorèse appropriés en fonction du mode d’analyse des anions ou des cations, puis appliquer des tensions.Remarque: les conditions d’instrumentation et d’analyse sont décrites en détail ailleurs12,13. Ouvrez le logiciel et préparez une réserve de travail contenant des méthodes d’acquisition de données et des exemples d’informations. Démarrez une série de tests et vérifiez les données telles que l’intensité du signal et la forme maximale des étalons internes et la résolution maximale d’autres composés standard. Affiner les conditions analytiques si nécessaire. Injecter les solutions d’échantillonnage à 50 mbar pour 3 s et une tension de 30 kV.Remarque: CE-MS a été effectué soit en mode ion positif ou négatif. Réglez le spectromètre pour numériser la plage de masse m/z 50 – 1000. La tension capillaire a été fixée à 4 kV; le débit d’azote gazeux (température du chauffe-eau 300 ° c). Pour le mode positif, le fragmentor, le skimmer et la tension de RFV OCT ont été fixés respectivement à 75, 50 et 125 V. Pour le mode d’ion négatif, la tension de fragmenteur, d’écumoire et de RFV OCT a été fixée respectivement à 100, 50 et 200 V. Analysez les données du spectre. Extrayez les pics des données spectrales de masse à l’aide d’un logiciel d’intégration automatique afin d’obtenir des informations de pointe, y compris m/z, zone de crête et temps de migration (MT).Remarque: la méthode est décrite en détail ailleurs14. Exclure les pics de signal correspondant aux isotopomères, aux ions d’adduit et à d’autres ions de produits de métabolites connus. Annotez les pics restants avec les informations de la base de données du métabolite HMT selon les valeurs m/z et MTS. Normalisez les zones des pics annotés aux niveaux standard internes et au nombre de cellules par échantillon. Évaluer la concentration de chaque métabolite dans les cellules cultivées (pmol/106 cellules) à l’aide de courbes standard préparées pour chaque métabolite. Utiliser les concentrations de métabolite quantifiées pour les analyses statistiques ultérieures et les interprétations biologiques14.