El análisis de múltiples biomoléculas en todo el sistema es crucial para obtener información funcional y mecanicista sobre los procesos biológicos. Por lo tanto, se describe un protocolo extenso para la extracción de alto rendimiento de lípidos, metabolitos, proteínas y almidón de una sola muestra cosechada del cultivo sincronizado de Chlamydomonas.
Las microalgas han sido el foco de investigación para sus aplicaciones en la producción de compuestos de alto valor, alimentos y combustible. Además, son valiosos modelos fotosintéticos que facilitan la comprensión de los procesos celulares básicos. Los estudios amplios del sistema permiten una comprensión completa y profunda de las funciones moleculares de los organismos. Sin embargo, se requieren múltiples muestras y protocolos independientes para estudios proteómicos, lipidómicos y metabolómicos que introducen un mayor error y variabilidad. Aquí se presenta un sólido método de extracción de alto rendimiento para la extracción simultánea de clorofila, lípidos, metabolitos, proteínas y almidón de una sola muestra de la alga verde Chlamydomonas reinhardtii. La configuración experimental ilustrada es para cultivos Chlamydomonas sincronizados utilizando condiciones de luz/oscuridad de 12 h/12 h. Se recogieron muestras durante un ciclo celular de 24 h para demostrar que los metabolitos, lípidos y datos de almidón obtenidos utilizando diversas plataformas analíticas están bien conformados. Además, se utilizaron muestras de proteínas recogidas utilizando el mismo protocolo de extracción para realizar análisis proteómicos detallados para evaluar su calidad y reproducibilidad. Sobre la base de los datos, se puede inferir que el método ilustrado proporciona un enfoque robusto y reproducible para avanzar en la comprensión de varias vías bioquímicas y sus funciones con mayor confianza para la investigación básica y aplicada.
Las microalgas son una rica fuente de productos naturales (por ejemplo, combustibles, nutrición humana y animal, cosméticos y sustancias farmacológicas). Numerosos esfuerzos de investigación se llevan a cabo para mejorar la eficiencia de la producción de productos de alto valor a partir de microalgas1,2,3,4. La comprensión a nivel de sistemas del metabolismo es unrequisito previo para mejorar la calidad y el rendimiento de los productos naturales 5,6,7. Con el advenimiento de técnicas genómicas funcionales y métodos mejorados de espectrometría de masas, miles de genes, transcripciones, proteínas y metabolitos pueden ser monitoreados simultáneamente. Sin embargo, se requieren múltiples muestras para estudios proteómicos, lipidómicos y metabolómicos en profundidad, que a menudo es difícil de lograr en organismos unicelulares, especialmente si se deben realizar estudios de curso de tiempo. Además, la recopilación y el procesamiento de diferentes alícuotas de muestra según los mismos en combinación con diferentes protocolos para recopilar los datos omics altamente complejos (es decir, proteómicos, lipidómicos y metabolómicos) introduce la variabilidad, haciendo de la integración de datos una tarea desafiante.
Chlamydomonas proporciona no sólo un excelente sistema microbiano para la investigación de procesos celulares, sino también un modelo conveniente para estudiar la coordinación del ciclo celular y el metabolismo. En consecuencia, se ha demostrado una fuerte coordinación de la expresión de transcripciones con el ciclo celular utilizando perfiles de transcriptoma de transcriptoma de alta resolución de cultivo sincronizado de Chlamydomonas8. Alrededor del 80% de las transcripciones analizadas mostraron una periodicidad robusta en un ciclo celular de 24 horas8. Del mismo modo, se demostró que el peso seco, las proteínas, la clorofila, los aminoácidos y los ácidos grasosde dos cepas diferentes de Chlamydomonas se correlacionaron con la división celular en un estudio en el que se realizaba el muestreo cada 4 h 9. Recientemente, se informó que la dinámica de metabolitos y lípidos del cambio celular basado en fases específicas del ciclo celular10. Los cambios sutiles en diferentes biomoléculas fueron posibles de monitorear usando un robusto éter de metilter-butilo (MTBE): metanol: método de extracción a base de agua, que ofrece un punto de partida ideal para el análisis multi-ómico integral10 , 11.
El protocolo presentado guía a través de una estrategia reproducible y eficiente10, para la extracción simultánea de lípidos, metabolitos, proteínas y almidón de una sola muestra de alícuota, para el estudio metabolómico y lipidómico resuelto por el tiempo de cultivos de Chlamydomonas de crecimiento sincrónico. Además de ilustrar los datos metabólicos y lipidémicos robustos y reproducibles10,aquí también se demuestra la calidad de las muestras proteómicas obtenidas del mismo pellet.
En este artículo, ilustramos un protocolo de extracción robusto y altamente aplicable para el análisis integral de lipidómica, metabolómica, almidón y proteómica a partir de un solo pellet de 10-15 x 106 células. El método se ha implementado con éxito en varios estudios para una amplia gama de células y tejidos10,14,21,22,23,24,25 ,26,27,28,29,30,31,32,33,34 ,35,36. Aquí, presentamos un gasoducto escalonado para el análisis multi-ómico de diferentes biomoléculas de una sola muestra cosechada del cultivo Chlamydomonas reinhardtii (CC-1690 mt+).
El protocolo proporciona un enfoque robusto y reproducible para procesar múltiples muestras a la vez, para el análisis de varias biomoléculas. Sin embargo, una serie de pasos críticos deben ser tomados cuidados con el fin de minimizar la variación técnica. En primer lugar, la recolección de las células debe realizarse lo más rápidamente posible manteniendo las condiciones uniformes para todas las muestras cosechadas para preservar el estado biológico de las células. Aunque utilizamos centrifugación para cosechar las células, se pueden utilizar estrategias de cosecha alternativas para la cosecha de las muestras. Sin embargo, es importante tener en cuenta que se sabe que diferentes estrategias de recolección influyen en el estado metabólico de las células37, por lo tanto, se debe utilizar un enfoque de cosecha consistente para todas las muestras experimentales. En segundo lugar, es importante evitar el secado de la fase no polar superior que contiene clorofila, ya que esto puede influir en los niveles de clorofila disuelta en el disolvente que afecta al factor de normalización de las muestras. Por último, se debe tener cuidado al retirar la fase polar restante para obtener la proteína y el pellet de almidón, para evitar perturbar el pellet que puede influir en el almidón y el contenido de proteína.
De este modo, el protocolo de extracción presentado ofrece varios beneficios para el análisis de datos de múltiples ómicos. Además de minimizar el número de alícuotas de muestra requeridas, también reduce la variación entre los resultados analíticos obtenidos para diferentes biomoléculas. Esto permite la comparación directa de los resultados obtenidos de los metabolitos primarios, lípidos y datos proteómicos. Del mismo modo, la extracción simultánea de varias clases compuestas permite una estrategia de normalización coherente y uniforme de los diferentes conjuntos de datos. Esto es especialmente aplicable si la normalización es difícil de lograr usando el peso seco o fresco38 o el número de celda.
El protocolo se puede implementar para el cribado rutinario de una muestra biológica compleja. Estos conjuntos holísticos de datos metabolómicos, lipidómicos y proteómicos pueden ofrecer información completa sobre los cambios sistemáticos en el metabolismo. Además, los datos obtenidos del análisis proteómico, proporcionan información sobre los cambios cuantitativos (abundancia) y cualitativos (modificaciones) en las proteínas en relación con los metabolitos. Por lo tanto, la integración de datos de omics podría revelar información detallada sobre los cambios inducidos por perturbaciones genéticas o bióticas y/o abióticas de un sistema biológico. Por lo tanto, elucidar los cambios moleculares de vías metabólicas específicas o procesos celulares. Del mismo modo, estos datos de alto rendimiento pueden permitir la identificación de objetivos para la ingeniería metabólica y refinar o probar predicciones de modelos metabólicos a escala del genoma37,39.
The authors have nothing to disclose.
Estamos muy agradecidos a Gudrun Wolter y a Michaelis por su excelente asistencia técnica. Nos gustaría dar las gracias a todos los miembros del laboratorio Giavalisco por su ayuda. Estamos agradecidos a la Sociedad Max Planck por financiar la investigación y FAPESP para la beca de L A Giraldi
Reagents and standards | |||
1,2-diheptadecanoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (17:0 PC) | Avanti Polar Lipids | 850360P | Internal standard for lipids |
13C Sorbitol | Sigma Aldrich | 605514 | Internal standard for metabolites, ISOTEC® Stable Isotopes |
Ampicillin | Sigma Aldrich | A9393-5G | Internal standard for metabolites |
Corticosterone | Sigma Aldrich | 27840-500MG | Internal standard for metabolites, HPLC grade |
Methanol (MeOH) | Biosolve Chemicals | 13684102 | ULC-MS grade |
Methyl tert-butyl ether (MTBE) | Biosolve Chemicals | 13890602 | HPLC grade |
Trypsin/Lys-C mix | Promega | V5072 | Enzymatic digestion of proteins |
Water | Biosolve Chemicals | 23214102 | ULC-MS grade |
Equipment | |||
1.5 ml Safe-lock microcentrifuge tubes | Eppendorf | 30120086 | Used for fractions |
2 ml Safe-lock microcentrifuge tubes | Eppendorf | 30120094 | Used for sample extarction |
Balance | Sartorius Corporation | 14 557 572 | |
Fermenter system | Glasbläserei Müller, Berlin, Germany | custom made fermenter of 800ml capacity | |
Q-exactive HF Orbitrap Mass Spectrometer | Thermo Scientific | IQLAAEGAAPFALGMBFZ | |
Refrigerated microcentrifuge | Eppendorf, model 5427R | 22620701 | |
Reversed Phase (RP) Bridged Ethyl Hybrid (BEH) C8 column (100 mm×2.1 mm containing 1.7 μm diameter particles) | Waters, Machester, UK | 186002878 | Analysis of lipids |
RP Charged Surface Hybrid (CSH) column (Waters) with an inner diameter of 75 μm and a particle size of 1.7 μm | Waters, Machester, UK | 186007477 | Analysis of proteins |
RP High Strength Silica (HSS) T3 column (100 mm×2.1 mm containing 1.8 μm diameter particles) | Waters, Machester, UK | 186003539 | Analysis of metabolites |
Shaker | Eppendorf Thermomixer 5436 | 2050-100-05 | |
Sonicator | USC 300 TH | 142-0084 | standard preset sonication power at 45kHz |
UPLC system | Waters Acquity UPLC system (Waters, Machester, UK) | ||
Vacuum concentrator | Scan Speed Maxi Vac Alpha Evaporators | 7.008.500.002 | |
Vortex mixer | Vortex-Genie 2, Model G560 | SI-0236 | |
Z2 Coulter Particle Count and Size Analyzer | Beckman Coulter | 6605700 | particle (cells) volume and number analyser |