Systemomfattande analys av flera biomolekyler är avgörande för att få funktionella och mekanistiska insikter i biologiska processer. Härmed beskrivs ett omfattande protokoll för hög genomströmning utvinning av lipider, metaboliter, proteiner och stärkelse från ett enda prov skördats från synkroniserade Chlamydomonas kultur.
Mikroalger har varit i fokus för forskning för sina tillämpningar i produktionen av högt värde föreningar, mat och bränsle. Dessutom är de värdefulla fotosyntetiska modeller som underlättar förståelsen av de grundläggande cellulära processerna. Systemomfattande studier möjliggör omfattande och djupgående förståelse av organismernas molekylära funktioner. Emellertid, flera oberoende prover och protokoll krävs för proteomik, lipidomik och metabolomik studier införa högre fel och variation. En robust hög genomströmning extraktion metod för samtidig utvinning av klorofyll, lipider, metaboliter, proteiner och stärkelse från ett enda prov av den gröna Alga Chlamydomonas reinhardtii presenteras här. Den illustrerade experimentella installationen är för Chlamydomonas kulturer synkroniseras med 12 h/12 h ljus/mörker förhållanden. Prover samlades in över en 24 h cell cykel för att visa att de metaboliter, lipider och stärkelse data som erhållits med hjälp av olika analytiska plattformar är väl utformade. Dessutom användes protein prov som samlats in med samma extraktionsprotokoll för att utföra detaljerad proteomikanalys för att utvärdera deras kvalitet och reproducerbarhet. Baserat på data kan man dra slutsatsen att den illustrerade metoden ger en robust och reproducerbar metod för att främja förståelsen av olika biokemiska vägar och deras funktioner med större förtroende för både grundläggande och tillämpad forskning.
Mikroalger är en rik källa av naturliga produkter (t. ex. bränslen, human-och djurfoder, kosmetika och farmakologiska ämnen). Ett stort antal forskningsinsatser görs för att effektivisera produktionen av produkter av hög värde från mikroalger1,2,3,4. System-nivå förståelse av metabolism är en förutsättning för att förbättra kvaliteten och avkastningen av naturliga produkter5,6,7. Med tillkomsten av funktionella genomiska tekniker och förbättrade masspektrometrimetoder kan tusentals gener, avskrifter, proteiner och metaboliter övervakas samtidigt. Emellertid, flera prover krävs för djupgående proteomik, lipidomik och metabolomik studier, som ofta är svåra att uppnå i encelliga organismer, särskilt om tid kurs studier ska utföras. Dessutom introducerar insamling och bearbetning av olika prov alikvoter i kombination med olika protokoll för att samla in de mycket komplexa omics-data (dvs. proteomik, lipidomic och metabolomics) variation, vilket gör integrationen av data a utmanande uppgift.
Chlamydomonas ger inte bara ett utmärkt mikrobiellt system för utredning av cellulära processer, men också en praktisk modell för att studera samordningen av cellcykeln och metabolism. Följaktligen har en stark samordning av transkriptioner uttryck med cell Cycle visats med högupplöst transkriptome profilering av synkroniserad kultur av Chlamydomonas8. Omkring 80% av de analyserade transkriptioner uppvisade robust periodicitet över en 24 h cell cykel8. Likaså visades torrvikt, proteiner, klorofyll, aminosyror och fettsyror av två olika stammar av Klamydomonas korrelera med celldelning i en studie där provtagning utfördes var 4 h9. Nyligen rapporterades det att metaboliten och lipiddynamiken i cell skiftet baserat på specifika faser av cellcykeln10. De subtila förändringarna i olika biomolekyler var möjliga att övervaka med hjälp av en robust metyltert-butylleter (MTBE): metanol: vattenbaserad extraktionsmetod, som erbjuder en idealisk utgångspunkt för omfattande multiomics-analys10 , 11.
Det presenterade protokollet vägleder genom en reproducerbar och effektiv strategi10, för samtidig utvinning av lipider, metaboliter, proteiner och stärkelse från ett enda prov alikvot, för tiden löst metabolomiska och lipidomikprofildata studie av synkrona växande Chlamydomonas kulturer. Förutom att illustrera de robusta och reproducerbara metaboliska och lipidomiska data10, här demonstreras också kvaliteten på de proteomiska proverna som erhålls från samma pellet.
I denna artikel, vi illustrerade en robust och mycket tillämplig extraktion protokoll för omfattande lipidomik, metabolomics, stärkelse och proteomik analys från en enda pellet av 10-15 x 106 celler. Metoden har genomförts framgångsrikt i flera studier för ett brett spektrum av celler och vävnader10,14,21,22,23,24,25 ,26,27,28,29,30,31,32,33,34 ,35,36. Här presenterade vi en stegvis pipeline för multiomics-analys av olika biomolekyler från ett enda prov som skördats från Chlamydomonas reinhardtii (CC-1690 MT +)-kulturen.
Protokollet ger en robust och reproducerbar metod för att bearbeta flera prover på en gång, för analys av olika biomolekyler. Ett antal kritiska steg bör dock tas om hand för att minimera den tekniska variationen. För det första bör skörd av cellerna göras så snabbt som möjligt samtidigt som de enhetliga villkoren för alla skördade prover bibehålls för att bevara cellernas biologiska tillstånd. Även om vi använde centrifugering för att skörda cellerna, kan alternativa skörde strategier användas för skörd av proverna. Det är dock viktigt att notera att olika skörde strategier är kända för att påverka det metabola tillståndet i cellerna37 därför måste konsekvent avverknings metod användas för alla experimentella prover. För det andra är det viktigt att undvika uttorkning av den övre icke-polära fasen som innehåller klorofyll, eftersom detta kan påverka halterna av upplöst klorofyll i lösningsmedlet som påverkar normaliserings faktorn för proverna. Slutligen, försiktighet bör iakttas när du tar bort den återstående Polar fasen för att få protein och stärkelse pellets, för att undvika att störa pelleten som kan påverka stärkelse och proteinhalt.
Därmed presenteras Extraction Protocol erbjuder flera fördelar för flera omics dataanalys. Förutom att minimera antalet prov portioner som krävs, minskar också variationen mellan de analytiska resultat som erhålls för olika biomolekyler. Detta möjliggör direkt jämförelse av de resultat som erhålls från de primära metaboliterna, lipider och proteomiska data. På samma sätt möjliggör samtidig utvinning av flera sammansatta klasser konsekvent och enhetlig normaliserings strategi för de olika datauppsättningarna. Detta gäller särskilt om normalisering är svårt att uppnå med torr eller färsk vikt38 eller cell nummer.
Protokollet kan genomföras för rutinmässig screening av ett komplext biologiskt prov. Dessa holistiska metabolomic, lipidomikprofildata och proteomiska datauppsättningar kan erbjuda omfattande information om systematiska förändringar i metabolismen. Dessutom, de data som erhållits från proteomik analys, ger insikter i den kvantitativa (överflöd) och kvalitativa (ändringar) förändringar i proteiner i förhållande till metaboliterna. Att integrera data från omics kan därför avslöja fördjupad information om förändringar som induceras av genetiska eller biotiska och/eller abiotiska störningar i ett biologiskt system. Således, belysa molekylära förändringar av specifika metaboliska vägar eller cellulära processer. På samma sätt kan dessa data med högt dataflöde tillåta identifiering av mål för den metaboliska tekniken och förfina eller testa förutsägelser från genomskalningsmetaboliska modeller37,39.
The authors have nothing to disclose.
Vi är mycket tacksamma mot Gudrun Wolter och Änne Michaelis för utmärkt teknisk assistans. Vi vill tacka alla medlemmar i Giavalisco Lab för deras hjälp. Vi är tacksamma till Max Planck Society för finansiering av forskning och FAPESP för gemenskap av L A Giraldi
Reagents and standards | |||
1,2-diheptadecanoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (17:0 PC) | Avanti Polar Lipids | 850360P | Internal standard for lipids |
13C Sorbitol | Sigma Aldrich | 605514 | Internal standard for metabolites, ISOTEC® Stable Isotopes |
Ampicillin | Sigma Aldrich | A9393-5G | Internal standard for metabolites |
Corticosterone | Sigma Aldrich | 27840-500MG | Internal standard for metabolites, HPLC grade |
Methanol (MeOH) | Biosolve Chemicals | 13684102 | ULC-MS grade |
Methyl tert-butyl ether (MTBE) | Biosolve Chemicals | 13890602 | HPLC grade |
Trypsin/Lys-C mix | Promega | V5072 | Enzymatic digestion of proteins |
Water | Biosolve Chemicals | 23214102 | ULC-MS grade |
Equipment | |||
1.5 ml Safe-lock microcentrifuge tubes | Eppendorf | 30120086 | Used for fractions |
2 ml Safe-lock microcentrifuge tubes | Eppendorf | 30120094 | Used for sample extarction |
Balance | Sartorius Corporation | 14 557 572 | |
Fermenter system | Glasbläserei Müller, Berlin, Germany | custom made fermenter of 800ml capacity | |
Q-exactive HF Orbitrap Mass Spectrometer | Thermo Scientific | IQLAAEGAAPFALGMBFZ | |
Refrigerated microcentrifuge | Eppendorf, model 5427R | 22620701 | |
Reversed Phase (RP) Bridged Ethyl Hybrid (BEH) C8 column (100 mm×2.1 mm containing 1.7 μm diameter particles) | Waters, Machester, UK | 186002878 | Analysis of lipids |
RP Charged Surface Hybrid (CSH) column (Waters) with an inner diameter of 75 μm and a particle size of 1.7 μm | Waters, Machester, UK | 186007477 | Analysis of proteins |
RP High Strength Silica (HSS) T3 column (100 mm×2.1 mm containing 1.8 μm diameter particles) | Waters, Machester, UK | 186003539 | Analysis of metabolites |
Shaker | Eppendorf Thermomixer 5436 | 2050-100-05 | |
Sonicator | USC 300 TH | 142-0084 | standard preset sonication power at 45kHz |
UPLC system | Waters Acquity UPLC system (Waters, Machester, UK) | ||
Vacuum concentrator | Scan Speed Maxi Vac Alpha Evaporators | 7.008.500.002 | |
Vortex mixer | Vortex-Genie 2, Model G560 | SI-0236 | |
Z2 Coulter Particle Count and Size Analyzer | Beckman Coulter | 6605700 | particle (cells) volume and number analyser |