Systemomfattende analyse av flere biomolekyler er avgjørende for å få funksjonell og mekanistisk innsikt i biologiske prosesser. En omfattende protokoll er herved beskrevet for høy gjennomstrømming ekstraksjon av lipider, metabolitter, proteiner og stivelse fra en enkelt prøve høstet fra synkronisert Chlamydomonas kultur.
Mikroalger har vært fokus for forskning for sine søknader i produksjon av høy verdi forbindelser, mat og drivstoff. Videre er de verdifulle fotosyntetiske modeller tilrettelegge forståelsen av de grunnleggende cellulære prosesser. Systemomfattende studier muliggjør omfattende og inngående forståelse av molekylære funksjoner av organismer. Det kreves imidlertid flere uavhengige prøver og protokoller for Proteomikk, lipidomics og Plantemetabolomikk studier som introduserer høyere feil og variasjon. En robust høy gjennomstrømning utvinningsmetode for samtidig ekstraksjon av klorofyll, lipider, metabolitter, proteiner og stivelse fra et enkelt utvalg av grønne Alga Chlamydomonas reinhardtii er presentert her. Den illustrerte eksperimentelle oppsettet er for Chlamydomonas kulturer synkronisert med 12 h/12 h lys/mørke forhold. Prøvene ble samlet inn over en 24 h celle syklus for å demonstrere at metabolitter, lipider og stivelse data innhentet ved hjelp av ulike analytiske plattformer er godt likedannet. Videre ble protein prøver som ble samlet inn ved hjelp av den samme utvinnings protokollen, brukt til å gjennomføre detaljert Proteomikk analyse for å evaluere kvaliteten og reproduserbarheten. Basert på data, kan det utledes at den illustrerte metoden gir en robust og reproduserbar tilnærming for å fremme forståelsen av ulike biokjemiske trasé og deres funksjoner med større tillit til både grunnleggende og anvendt forskning.
Mikroalger er en rik kilde av naturlige produkter (for eksempel brensel, mennesker og dyr ernæring, kosmetikk og farmakologiske stoffer). En rekke forsknings tiltak gjennomføres for å øke effektiviteten ved produksjon av høyverdiprodukter fra mikroalger1,2,3,4. Systemer-nivå forståelse av metabolisme er en forutsetning for å forbedre kvaliteten og avkastningen av naturlige produkter5,6,7. Med bruk av funksjonelle genomisk teknikker og forbedrede masse massespektrometri metoder, kan tusenvis av gener, transkripsjoner, proteiner og metabolitter overvåkes samtidig. Det er imidlertid nødvendig med flere eksempler for dyptgående Proteomikk, lipidomics og Plantemetabolomikk studier, som ofte er vanskelig å oppnå i encellede organismer, spesielt hvis det skal utføres tids kurs studier. Videre, innsamling og behandling av ulike sample alikvoter i kombinasjon med ulike protokoller for å samle de svært komplekse omics data (dvs. Proteomikk, lipidomic, og Plantemetabolomikk) introduserer variasjon, og dermed gjør integreringen av data en utfordrende oppgave.
Chlamydomonas gir ikke bare en utmerket mikrobiell system for etterforskning av cellulære prosesser, men også en praktisk modell for å studere koordinering av celle syklus og metabolisme. Følgelig er en sterk koordinering av transkripsjoner uttrykk med celle syklus vist ved hjelp av høyoppløselig transcriptome profilering av synkronisert kultur Chlamydomonas8. Om 80% av de analyserte transkripsjoner utstilt robuste periodisitet over en 24 h celle syklus8. Likeledes ble tørr vekt, proteiner, klorofyll, aminosyrer og fettsyrer av to forskjellige stammer av Chlamydomonas vist å relatere med celledeling i en studie der prøvetaking ble utført hver 4 h9. Nylig ble det rapportert at metabolitten og lipid dynamikk av celle Skift basert på bestemte faser av cellen syklus10. De subtile endringene i forskjellige biomolekyler var mulig å overvåke ved hjelp av en robust methyl tert-butyl ETER (MTBE): metanol: vannbasert utvinningsmetode, som gir et ideelt utgangspunkt for omfattende multi-omics analyse10 , 11i.
De presenterte protokollen guider gjennom en reproduserbar og effektiv strategi10, for samtidig ekstraksjon av lipider, metabolitter, proteiner og stivelse fra en enkelt prøve alikvot, for tiden løst metabolomic og lipidomic studie av synkron voksende Chlamydomonas kulturer. I tillegg til å illustrere de robuste og reproduserbar metabolske og lipidomic data10, her er kvaliteten på Proteomikk prøvene Hentet fra samme pellet også demonstrert.
I denne artikkelen, illustrerte vi en robust og svært gjeldende utvinnings protokoll for omfattende lipidomics, Plantemetabolomikk, stivelse og Proteomikk analyse fra en enkelt pellets på 10-15 x 106 celler. Metoden er implementert i flere studier for et bredt spekter av celler og vev10,14,21,22,23,24,25 ,26,27,28,29,30,31,32,33,34 ,35,36. Her presenterte vi en trinnvis rørledning for multi-omics analyse av forskjellige biomolekyler fra en enkelt prøve høstet fra Chlamydomonas reinhardtii (CC-1690 Mt +) kultur.
Protokollen gir en robust og reproduserbar tilnærming til å behandle flere prøver på en gang, for analyse av ulike biomolekyler. Imidlertid bør en rekke kritiske skritt bli tatt vare på for å minimere den tekniske varianten. For det første bør høsting av cellene gjøres så raskt som mulig og samtidig opprettholde de ensartede forhold for alle høstet prøver for å bevare den biologiske tilstanden i cellene. Selv om vi brukte sentrifugering å høste cellene, alternative høsting strategier kan brukes til høsting av prøvene. Det er imidlertid viktig å merke seg at ulike høsting strategier er kjent for å påvirke metabolske tilstanden i cellene37 derfor må konsekvent høsting tilnærming brukes for alle eksperimentelle prøver. Dernest er det viktig å unngå tørking av øvre ikke-Polar fase inneholder klorofyll, siden dette kan påvirke nivåene av oppløst klorofyll i løsningsmidlet påvirker normalisering faktor for prøvene. Til slutt, forsiktighet bør utvises mens du fjerner den gjenværende Polar fase for å få protein og stivelse pellet, for å unngå å forstyrre pellet som kan påvirke stivelse og proteininnhold.
Dermed presenteres utvinnings protokoll tilbyr flere fordeler for fler omics dataanalyse. I tillegg til å minimere antall prøve alikvoter som kreves, reduserer det også variasjonen mellom de analytiske resultatene som oppnås for ulike biomolekyler. Dette tillater direkte sammenligning av resultatene innhentet fra de primære metabolitter, lipider og Proteomikk data. Tilsvarende tillater samtidig ekstraksjon av flere sammensatte klasser konsistent og ensartet normalisering strategi av de ulike datasettene. Dette er spesielt aktuelt hvis normalisering er vanskelig å oppnå ved hjelp av tørr eller frisk vekt38 eller celle nummer.
Protokollen kan implementeres for rutinemessig screening av en kompleks biologisk prøve. Disse holistiske metabolomic, lipidomic og Proteomikk datasettene kan tilby omfattende informasjon om systematiske endringer i metabolismen. I tillegg data innhentet fra Proteomikk analyse, gir innsikt i kvantitative (overflod) og kvalitative (modifikasjoner) endringer i proteiner i forhold til metabolitter. Derfor, integrere omics data kunne avsløre inne-dybden opplysninger på endre fremkalt av genetisk eller biotiske og/eller abiotiske forstyrrelser av en Biological system. Dermed Elucidating molekylære endringer av spesifikke metabolske trasé eller cellulære prosesser. På samme måte, disse høy-gjennomstrømming data kan tillate identifisering av mål for metabolsk engineering og avgrense eller test spådommer fra Genova-skala metabolske modeller37,39.
The authors have nothing to disclose.
Vi er svært takknemlige for Gudrun Wolter og Änne Michaelis for utmerket teknisk assistanse. Vi vil gjerne takke alle medlemmene av Giavalisco-laboratoriet for deres hjelp. Vi er takknemlige til Max Planck Society for finansiering av forskning og FAPESP for fellesskap av L A Giraldi
Reagents and standards | |||
1,2-diheptadecanoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (17:0 PC) | Avanti Polar Lipids | 850360P | Internal standard for lipids |
13C Sorbitol | Sigma Aldrich | 605514 | Internal standard for metabolites, ISOTEC® Stable Isotopes |
Ampicillin | Sigma Aldrich | A9393-5G | Internal standard for metabolites |
Corticosterone | Sigma Aldrich | 27840-500MG | Internal standard for metabolites, HPLC grade |
Methanol (MeOH) | Biosolve Chemicals | 13684102 | ULC-MS grade |
Methyl tert-butyl ether (MTBE) | Biosolve Chemicals | 13890602 | HPLC grade |
Trypsin/Lys-C mix | Promega | V5072 | Enzymatic digestion of proteins |
Water | Biosolve Chemicals | 23214102 | ULC-MS grade |
Equipment | |||
1.5 ml Safe-lock microcentrifuge tubes | Eppendorf | 30120086 | Used for fractions |
2 ml Safe-lock microcentrifuge tubes | Eppendorf | 30120094 | Used for sample extarction |
Balance | Sartorius Corporation | 14 557 572 | |
Fermenter system | Glasbläserei Müller, Berlin, Germany | custom made fermenter of 800ml capacity | |
Q-exactive HF Orbitrap Mass Spectrometer | Thermo Scientific | IQLAAEGAAPFALGMBFZ | |
Refrigerated microcentrifuge | Eppendorf, model 5427R | 22620701 | |
Reversed Phase (RP) Bridged Ethyl Hybrid (BEH) C8 column (100 mm×2.1 mm containing 1.7 μm diameter particles) | Waters, Machester, UK | 186002878 | Analysis of lipids |
RP Charged Surface Hybrid (CSH) column (Waters) with an inner diameter of 75 μm and a particle size of 1.7 μm | Waters, Machester, UK | 186007477 | Analysis of proteins |
RP High Strength Silica (HSS) T3 column (100 mm×2.1 mm containing 1.8 μm diameter particles) | Waters, Machester, UK | 186003539 | Analysis of metabolites |
Shaker | Eppendorf Thermomixer 5436 | 2050-100-05 | |
Sonicator | USC 300 TH | 142-0084 | standard preset sonication power at 45kHz |
UPLC system | Waters Acquity UPLC system (Waters, Machester, UK) | ||
Vacuum concentrator | Scan Speed Maxi Vac Alpha Evaporators | 7.008.500.002 | |
Vortex mixer | Vortex-Genie 2, Model G560 | SI-0236 | |
Z2 Coulter Particle Count and Size Analyzer | Beckman Coulter | 6605700 | particle (cells) volume and number analyser |