जैविक प्रक्रियाओं में कार्यात्मक और मशीनी अंतर्दृष्टि प्राप्त करने के लिए कई जैव अणुओं का सिस्टम-व्यापी विश्लेषण महत्वपूर्ण है। इसके द्वारा, एक व्यापक प्रोटोकॉल सिंक्रनाइज़ Chlamydomonas संस्कृति से काटा एक एकल नमूना से लिपिड, चयापचयों, प्रोटीन और स्टार्च के उच्च थ्रूपुट निष्कर्षण के लिए वर्णित है।
Microalgae उच्च मूल्य यौगिकों, भोजन और ईंधन के उत्पादन में अपने अनुप्रयोगों के लिए अनुसंधान का ध्यान केंद्रित किया गया है. इसके अलावा, वे मूल्यवान प्रकाश संश्लेषण मॉडल बुनियादी सेलुलर प्रक्रियाओं की समझ को सुविधाजनक बना रहे हैं. प्रणाली व्यापक अध्ययन जीवों के आणविक कार्यों की व्यापक और गहन समझ सक्षम. हालांकि, कई स्वतंत्र नमूने और प्रोटोकॉल proteomics के लिए आवश्यक हैं, लिपिडोमिक्स और metabolmics उच्च त्रुटि और परिवर्तनशीलता शुरू अध्ययन. हरे alga Lamydomonas reinhardtii के एक नमूने से क्लोरोफिल, लिपिड, चयापचयों, प्रोटीन और स्टार्च के एक साथ निष्कर्षण के लिए एक मजबूत उच्च थ्रूपुट निष्कर्षण विधि यहाँ प्रस्तुत किया जाता है। सचित्र प्रयोगात्मक सेटअप 12 h/12 h प्रकाश / नमूने एक 24 एच सेल चक्र पर एकत्र करने के लिए प्रदर्शित करता है कि चयापचयों, लिपिड और स्टार्च डेटा विभिन्न विश्लेषणात्मक प्लेटफार्मों का उपयोग कर प्राप्त अच्छी तरह से अनुरूप हैं. इसके अलावा, एक ही निष्कर्षण प्रोटोकॉल का उपयोग कर एकत्र प्रोटीन नमूने उनकी गुणवत्ता और reproducibility का मूल्यांकन करने के लिए विस्तृत proteomics विश्लेषण का संचालन करने के लिए इस्तेमाल किया गया. आंकड़ों के आधार पर, यह अनुमान लगाया जा सकता है कि सचित्र विधि बुनियादी और लागू अनुसंधान दोनों के लिए अधिक से अधिक विश्वास के साथ विभिन्न जैव रासायनिक रास्ते और उनके कार्यों की समझ अग्रिम करने के लिए एक मजबूत और पुन: उत्पादनीय दृष्टिकोण प्रदान करता है।
Microalgae प्राकृतिक उत्पादों (उदा., ईंधन, मानव और पशु पोषण, सौंदर्य प्रसाधन और औषधीय पदार्थ) का एक समृद्ध स्रोत हैं। सूक्ष्म शैवाल1,2,3,4से उच्च मूल्य के उत्पादों के उत्पादन की दक्षता बढ़ाने के लिए अनेक अनुसंधान प्रयास किए जाते हैं . चयापचय की प्रणाली-स्तर की समझ प्राकृतिक उत्पादों की गुणवत्ता और उपज में सुधार करने के लिए एक पूर्व-आवश्यकता है5,6,7. कार्यात्मक जीनोमिक तकनीकों और बेहतर मास स्पेक्ट्रोमेट्री तरीकों के आगमन के साथ, जीन के हजारों, प्रतिलिपि, प्रोटीन, और चयापचयों एक साथ नजर रखी जा सकती है. हालांकि, कई नमूनों में गहराई से proteomics, लिपिडोमिक्स और metabolomics अध्ययन के लिए आवश्यक हैं, जो अक्सर एककोशिक ीय जीवों में प्राप्त करने के लिए मुश्किल है, खासकर अगर समय पाठ्यक्रम अध्ययन किया जा रहे हैं. इसके अलावा, संग्रह और विभिन्न प्रोटोकॉल के साथ संयोजन में विभिन्न नमूना alicots के प्रसंस्करण के लिए अत्यधिक जटिल omics डेटा इकट्ठा करने के लिए (यानी, proteomic, lipidomic, और metabolomics) परिवर्तनशीलता का परिचय, इस प्रकार डेटा के एकीकरण एक बनाने चुनौतीपूर्ण कार्य.
क्लैमाइडोमोनास सेलुलर प्रक्रियाओं की जांच के लिए न केवल एक उत्कृष्ट माइक्रोबियल प्रणाली प्रदान करता है, बल्कि सेल चक्र और चयापचय के समन्वय का अध्ययन करने के लिए एक सुविधाजनक मॉडल भी प्रदान करता है। तदनुसार, सेल चक्र के साथ प्रतिलिपि अभिव्यक्ति का एक मजबूत समन्वय Chlamydomonas8के सिंक्रनाइज़ संस्कृति के उच्च संकल्प transcriptome रूपरेखा का उपयोग कर दिखाया गया है. विश्लेषित प्रतिलिपिके लगभग 80% ने 24 एच सेल चक्र8में मजबूत आवधिकता का प्रदर्शन किया . इसी तरह, शुष्क वजन, प्रोटीन, क्लोरोफिल, एमिनो एसिड और क्लैमाइडोमोना के दो अलग अलग उपभेदों के फैटी एसिड एक अध्ययन में सेल विभाजन के साथ सहसंबंधित करने के लिए दिखाया गया था जहां नमूना हर 4 एच9प्रदर्शन किया गया था। हाल ही में, यह बताया गया था कि सेल चक्र10के विशिष्ट चरणों के आधार पर सेल शिफ्ट की मेटाबोलाइट और लिपिड गतिशीलता । विभिन्न जैव अणुओं में सूक्ष्म परिवर्तन एक मजबूत मिथाइल tertका उपयोग कर निगरानी करने के लिए संभव थे -butyl ईथर (MTBE): मेथनॉल: पानी आधारित निष्कर्षण विधि, जो व्यापक बहु-ओमिक्स विश्लेषण के लिए एक आदर्श प्रारंभिक बिंदु प्रदान करता है10 , 11|
प्रस्तुत प्रोटोकॉल गाइड एक reproduible और कुशल रणनीति के माध्यम से10, लिपिड के एक साथ निष्कर्षण के लिए, चयापचयों, प्रोटीन और स्टार्च एक एकल नमूना alicot से, समय के लिए हल metabolomic और लिपिडोमिक अध्ययन के लिए तुल्यकालिक बढ़ रही क्लैमाइडोमोनास संस्कृतियों. मजबूत और reproduible चयापचय और लिपिडोमिक डेटा उदाहरण के अलावा10,यहाँ, एक ही गोली से प्राप्त proteomic नमूनों की गुणवत्ता भी प्रदर्शन किया है.
इस लेख में, हम 10-15 x 106 कोशिकाओं के एक गोली से व्यापक lipidomics, metabolomics, स्टार्च और proteomics विश्लेषण के लिए एक मजबूत और अत्यधिक लागू निष्कर्षण प्रोटोकॉल सचित्र. विधि सफलतापूर्वक कोशिकाओं और ऊतकों की एक विस्तृत श्रृंखला के लिए कई अध्ययनों में लागू किया गया है10,14,21,22,23,24,25 ,26,27,28,29,30,31,32,33,34 ,35,36. यहाँ, हम क्लैमिडोमोनास reinhardtii (CC-1690 मीटर +) संस्कृति से काटा एक नमूना से विभिन्न जैव अणुओं के बहु-ओमिक्स विश्लेषण के लिए एक कदमवार पाइप लाइन प्रस्तुत की।
प्रोटोकॉल विभिन्न जैव अणुओं के विश्लेषण के लिए, एक बार में कई नमूनों को संसाधित करने के लिए एक मजबूत और पुन: उत्पादनीय दृष्टिकोण प्रदान करता है। तथापि, तकनीकी भिन्नता को कम करने के लिए अनेक महत्वपूर्ण कदम उठाए जाने चाहिए। सबसे पहले, कोशिकाओं की जैविक स्थिति को बनाए रखने के लिए सभी काटे गए नमूनों के लिए एक समान शर्तों को बनाए रखते हुए कोशिकाओं की कटाई जितनी जल्दी हो सके की जानी चाहिए। यद्यपि हमने कोशिकाओं को काटने के लिए अपकेंद्रण का उपयोग किया था, फिर भी नमूनों की कटाई के लिए वैकल्पिक कटाई रणनीतियों का उपयोग किया जा सकता है। हालांकि, यह ध्यान रखना महत्वपूर्ण है कि विभिन्न कटाई रणनीतियों कोशिकाओं की चयापचय स्थिति को प्रभावित करने के लिए जाना जाता है37 इसलिए, लगातार कटाई दृष्टिकोण सभी प्रयोगात्मक नमूनों के लिए इस्तेमाल किया जाना चाहिए. दूसरे, ऊपरी गैर-ध्रुवीय चरण जिसमें क्लोरोफिल के सूखने से बचना महत्वपूर्ण है, क्योंकि यह नमूनों के लिए सामान्यीकरण कारक को प्रभावित करने वाले विलायक में भंग क्लोरोफिल के स्तर को प्रभावित कर सकता है। अंत में, प्रोटीन और स्टार्च गोली प्राप्त करने के लिए शेष ध्रुवीय चरण को हटाने के दौरान देखभाल की जानी चाहिए, गोली जो स्टार्च और प्रोटीन सामग्री को प्रभावित कर सकते हैं परेशान से बचने के लिए.
इस तरह प्रस्तुत निष्कर्षण प्रोटोकॉल एकाधिक-omics डेटा विश्लेषण के लिए कई लाभ प्रदान करता है. आवश्यक नमूना alicots की संख्या को कम करने के अलावा, यह भी विभिन्न जैव अणुओं के लिए प्राप्त विश्लेषणात्मक परिणामों के बीच भिन्नता कम कर देता है। यह प्राथमिक चयापचयों, लिपिड और प्रोटीओमिक डेटा से प्राप्त परिणामों की सीधी तुलना की अनुमति देता है। इसी प्रकार, एकाधिक यौगिक वर्गों का एक साथ निष्कर्षण विभिन्न डेटा सेटों की संगत और समान सामान्यीकरण रणनीति की अनुमति देता है। यह विशेष रूप से लागू होता है अगर सामान्यीकरण शुष्क या ताजा वजन38 या सेल संख्या का उपयोग कर प्राप्त करने के लिए मुश्किल है.
प्रोटोकॉल एक जटिल जैविक नमूने की नियमित जांच के लिए लागू किया जा सकता है. ये समग्र मेटाब्लोलोमिक, लिपिडोमिक और प्रोटीओमिक डेटा सेट चयापचय में व्यवस्थित परिवर्तन के बारे में व्यापक जानकारी प्रदान कर सकते हैं। इसके अतिरिक्त, प्रोटीओमिक्स विश्लेषण से प्राप्त डेटा, चयापचयों के संबंध में प्रोटीन में मात्रात्मक (बहुतायत) और गुणात्मक (संशोधन) परिवर्तन में अंतर्दृष्टि प्रदान करता है। अतः ओमिक्स डेटा को एकीकृत करने से आनुवंशिक या जैविक और/अथवा जैविक प्रणाली के अजैविक क्षोभ क्षोभ के कारण होने वाले परिवर्तनों के बारे में गहन जानकारी प्रकट हो सकती है। इस प्रकार, विशिष्ट चयापचय रास्ते या सेलुलर प्रक्रियाओं के आणविक परिवर्तन स्पष्ट. इसी प्रकार, ये उच्च-थ्रूपुट डेटा चयापचय अभियांत्रिकी के लिए लक्ष्यों की पहचान की अनुमति दे सकते हैं और जीनोम-स्केल चयापचय मॉडल37,39से परिष्कृत या परीक्षण भविष्यवाणियों की अनुमति दे सकते हैं।
The authors have nothing to disclose.
हम उत्कृष्ट तकनीकी सहायता के लिए Gudrun Wolter और nne Michaelis के लिए बहुत आभारी हैं. हम उनकी मदद के लिए Giavalisco प्रयोगशाला के सभी सदस्यों को धन्यवाद देना चाहूंगा. हम एल ए Giraldi की फैलोशिप के लिए अनुसंधान और FAPESP वित्त पोषण के लिए मैक्स प्लैंक सोसायटी के आभारी हैं
Reagents and standards | |||
1,2-diheptadecanoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (17:0 PC) | Avanti Polar Lipids | 850360P | Internal standard for lipids |
13C Sorbitol | Sigma Aldrich | 605514 | Internal standard for metabolites, ISOTEC® Stable Isotopes |
Ampicillin | Sigma Aldrich | A9393-5G | Internal standard for metabolites |
Corticosterone | Sigma Aldrich | 27840-500MG | Internal standard for metabolites, HPLC grade |
Methanol (MeOH) | Biosolve Chemicals | 13684102 | ULC-MS grade |
Methyl tert-butyl ether (MTBE) | Biosolve Chemicals | 13890602 | HPLC grade |
Trypsin/Lys-C mix | Promega | V5072 | Enzymatic digestion of proteins |
Water | Biosolve Chemicals | 23214102 | ULC-MS grade |
Equipment | |||
1.5 ml Safe-lock microcentrifuge tubes | Eppendorf | 30120086 | Used for fractions |
2 ml Safe-lock microcentrifuge tubes | Eppendorf | 30120094 | Used for sample extarction |
Balance | Sartorius Corporation | 14 557 572 | |
Fermenter system | Glasbläserei Müller, Berlin, Germany | custom made fermenter of 800ml capacity | |
Q-exactive HF Orbitrap Mass Spectrometer | Thermo Scientific | IQLAAEGAAPFALGMBFZ | |
Refrigerated microcentrifuge | Eppendorf, model 5427R | 22620701 | |
Reversed Phase (RP) Bridged Ethyl Hybrid (BEH) C8 column (100 mm×2.1 mm containing 1.7 μm diameter particles) | Waters, Machester, UK | 186002878 | Analysis of lipids |
RP Charged Surface Hybrid (CSH) column (Waters) with an inner diameter of 75 μm and a particle size of 1.7 μm | Waters, Machester, UK | 186007477 | Analysis of proteins |
RP High Strength Silica (HSS) T3 column (100 mm×2.1 mm containing 1.8 μm diameter particles) | Waters, Machester, UK | 186003539 | Analysis of metabolites |
Shaker | Eppendorf Thermomixer 5436 | 2050-100-05 | |
Sonicator | USC 300 TH | 142-0084 | standard preset sonication power at 45kHz |
UPLC system | Waters Acquity UPLC system (Waters, Machester, UK) | ||
Vacuum concentrator | Scan Speed Maxi Vac Alpha Evaporators | 7.008.500.002 | |
Vortex mixer | Vortex-Genie 2, Model G560 | SI-0236 | |
Z2 Coulter Particle Count and Size Analyzer | Beckman Coulter | 6605700 | particle (cells) volume and number analyser |