Atomische Absorbance-Spektroskopie zur Messung von intrazellulären Zink-Pools in den Mamänarchalzellen

Transition und Schwermetalle wie Zn, Cu, Mn und Fe finden sich naturgemäß in der Umwelt sowohl bei Nährstoffen in Lebensmitteln als auch bei Schadstoffen. Alle Lebewesen benötigen unterschiedliche Mengen dieser Mikronährstoffe; Die Exposition gegenüber hohen Werten ist jedoch schädlich für Organismen. Die Metallergewinnung erfolgt vor allem über die Diät, aber Metalle können auch über die Haut^{1,2, 3,4,}5 eingeatmet oder aufgenommen werden. Es ist wichtig zu beachten, dass das Vorhandensein von Metallen in atmosphärischen Partikeln zunimmt und weitgehend mit Gesundheitsrisiken in Verbindung gebracht wurde. Aufgrund von anthropogenen Aktivitäten wurden erhöhte Schwermetallwerte wie Ag, As, Cd, Cr, Hg, Ni, Fe und Pb in atmosphärischen Feinstaub, Regenwasser und Boden6,7^festgestellt. Diese Metalle haben das Potenzial, mit wesentlichen physiologischen Spurenelementen, insbesondere Zn und Fe, zu konkurrieren, und sie führen zu toxischen Effekten, indem sie grundlegende Enzyme für biologische Prozesse inaktivieren.

Das Spurenelement Zn ist redox-neutral und verhält sich als Lewis-Säure in biologischen Reaktionen, was es zu einem grundlegenden Kofaktor macht, der für die Proteinfaltung und Katalysatoraktivität inüber 10% der Säugetierproteine 8,^{9 notwendig ist. 10}; Daher ist es für die verschiedenen physiologischen Funktionen^{8,11unerlässlich}. Wie bei vielen Spurenelementen gibt es jedoch ein empfindliches Gleichgewicht zwischen diesen Metallen, das eine normale physiologische Funktion ermöglicht und Toxizität verursacht. Bei Säugetieren führen Zn-Mängel zu Anämie, Wachstumsverzögerung, Hypogonadismus, Hautanomalien, Durchfall, Alopezie, Geschmacksstörungen, chronischen Entzündungen und beeinträchtigten Immun-und neurologischen Funktionen¹¹, 12^{, 13,14, 15, 16,17},^18. Darüber hinaus ist Zn zytotoxisch und beeinträchtigt die Aufnahme anderer essentieller Metalle wie Kupfer^{19, 20,21.}

Darüber hinaus haben einige Metalle wie Cu und Fe das Potenzial, an schädlichen Reaktionen teilzunehmen. Die Produktion von reaktiven Sauerstoffarten (ROS) über die Fenton-Chemie kann die Ansammlung von Eisenglupelclubproteinen stören undden Fettstoffwechsel 22,23^{,24verändern}. Um diesen Schaden zu verhindern, nutzen Zellen metallbindende Begleitpersonen und Transporter, um toxische Wirkungen zu verhindern. Zweifellos muss die Metall-Homöostase streng kontrolliert werden, um sicherzustellen, dass bestimmte Zelltypen das richtige Niveau der Metalle beibehalten. Aus diesem Grund ist es wichtig, Techniken zur genauen Messung von Spurenmetallen in biologischen Proben voranzutreiben. In Entwicklungs-und Reifungsorganismen besteht ein differenzierter biologischer Bedarf an Spurenelementen auf zellulärer Ebene, in verschiedenen Entwicklungsstadien und in normalen und pathologischen Bedingungen. Daher ist eine genaue Bestimmung des Gewebes und der systemischen Metallwerte notwendig, um die organisatorische Metall-Homöostase zu verstehen.

Graphitofen Atomabsorptionsspektrometrie (GF-AAS) ist eine hochempfindliche Technik, die für kleine Probenmengen verwendet wird, so dass sie ideal ist, um Übergänge und Schwermetalle zu messen, die in biologischen und ökologischen Proben 25^,26 vorhanden sind. ^{, 27 , 28}. Außerdem hat sich aufgrund der hohen Empfindlichkeit der Technik gezeigt, dass sie geeignet ist, die Feintransporteigenschaften von Na⁺/-ATPase und Mage H⁺/ATPase mit Xenopus zu untersuchen. Eizellen als Modellsystem²⁹. In GF-AAS absorbieren die atomisierten Elemente innerhalb einer Probe eine Wellenlänge der Strahlung, die von einer Lichtquelle emittiert wird, die das Metall von Interesse enthält, wobei die absorbierte Strahlung proportional zur Konzentration des Elements ist. Die elementare elektronische Erregung erfolgt bei der Aufnahme von ultravioletter oder sichtbarer Strahlung in einem quantisierten Prozess, der für jedes chemische Element einzigartig ist. In einem einzigen Elektronenprozess besteht die Aufnahme eines Photons durch ein Elektron, das sich von einem niedrigeren Energieniveau auf eine höhere Ebene innerhalb des Atoms bewegt, und GF-AAS bestimmt die Menge der Photonen, die von der Probe absorbiert werden, was proportional zur Anzahl der Strahlung ist, die absorbiert. Elemente, die im Graphitrohr zerstäubt sind.

Die Selektivität dieser Technik beruht auf der elektronischen Struktur der Atome, in denen jedes Element eine spezifische absorption/emissionsspektrale Linie hat. Bei Zn beträgt die Absorbance-Wellenlänge 213,9 nm und kann sich exakt von anderen Metallen unterscheiden. Insgesamt kann GF-AAS verwendet werden, um Zn mit adäquaten Grenzen der Erkennung (LOD) und hoher Empfindlichkeit undSelektivität 25 zu quantifizieren. Die Veränderungen in der absorbierten Wellenlänge werden integriert und als Spitzen der Energieaufnahme an bestimmten und isolierten Wellenlängen dargestellt. Die Konzentration des Zn in einer bestimmten Probe wird in der Regel aus einer Standardkurve bekannter Konzentrationen nach dem Beer-Lambert-Gesetz berechnet, in der die Absorption direkt proportional zur Zn-Konzentration in der Probe ist. Die Anwendung der Beer-Lambert-Gleichung auf GF-AAS-Analysen stellt jedoch auch einige Komplikationen dar. So können beispielsweise Schwankungen in der Atomisierung und in den nicht-homogenen Konzentrationen der Proben die Metallmessungen beeinflussen.

Die für die Elementaranalyse der GF AAS-Spur erforderliche Metallatomisierung besteht aus drei grundlegenden Schritten. Der erste Schritt ist die Verwüstung, bei der das flüssige Lösungsmittel verdampft wird; Trockene Verbindungen nach dem Ofen erreichen eine Temperatur von etwa 100 ° C. Dann werden die Verbindungen verdampft, indem sie von 800 bis 1.400 ° C (je nach zu analysierendes Element) erhitzt werden und zu einem Gas werden. Schließlich werden die Verbindungen im gasförmigen Zustand mit Temperaturen von 1.500 bis 2.500 ° C atomisiert. Wie bereits erwähnt, werden die zunehmenden Konzentrationen eines Metalls von Interesse proportional auf die vom GF-AAS festgestellte Absorption steigen, aber der Ofen reduziert den dynamischen Analysebereich, der den Arbeitsbereich der Konzentrationen darstellt, die sein können. Vom Instrument bestimmt. So erfordert die Technik niedrige Konzentrationen und eine sorgfältige Bestimmung des dynamischen Bereichs der Methode, indem die LOD und die Grenze der Linearität (LOL) des Bier-Lambert-Gesetzes festgelegt werden. Die LOD ist die Mindestmenge, die für die Erkennung eines Stoffes benötigt wird, definiert als das Dreifache der Standardabweichung von Zn in der Matrix. Die LOL ist die maximale Konzentration, die mit Beer-Lambert-Gesetz erkannt werden kann.

In dieser Arbeit beschreiben wir eine Standardmethode zur Analyse der Zn-Werte in ganzen Zellextrakten, zytoplasmatischen und nuklearen Brüchen und in der Vermehrung und Differenzierung kultivierter Zellen (Abbildung1). Wir haben die schnelle Isolierung des Kernprotokolls an verschiedene Zellsysteme angepasst, um den Metallverlust während der Probenvorbereitung zu verhindern. Die verwendeten zellulären Modelle waren primäre Myoblasten, die von Satellitenzellen der Maus abgeleitet wurden, Murine neuroblastoma-Zellen (N2A oder Neuro2A), Murine 3T3 L1-Adipozyten, eine menschliche nicht-tumorische Brustepithelzelllinie (MCF10A) und epitheliale Madin-Darby-Kaninchen-Niere ( MDCK) Zellen. Diese Zellen wurden aus verschiedenen Linien hergestellt und sind gute Modelle für die Untersuchung von linearahmen spezifischen Variationen von Metallstufen in vitro.

Primäre Myoblasten, die von Maus-Satelliten abgeleitet werden, stellen ein gut geeignetes In-vitro-Modell dar, um die Skelettmuskeldifferenzierung zu untersuchen. Die Proliferation dieser Zellen ist schnell, wenn sie unter hohen Serumbedingungen kultiviert werden. Die Differenzierung in die muskuläre Abstammung wird dann durch niedrige Serumbedingungen 30 induziert. Das Murin-Neuroblastom (N2A), das eine Zelllinie festgestellt hat, wurde aus dem neuronalen Kamm der Maus abgeleitet. Diese Zellen präsentieren neuronale und amoeboide Stammzellmorphologie. Bei Differenzierungsreizen weisen die N2A-Zellen mehrere Eigenschaften von Neuronen auf, wie Neurofilamente. N2A-Zellen werden zur Untersuchung der Alzheimer-Krankheit, des Neuriten-Auswuchses^undder Neurotoxizität 31,32,^33eingesetzt. Die 3T3-L1-Murin-Pre-Adipozyten etablierte Zelllinie wird häufig verwendet, um die metabolischen und physiologischen Veränderungen zu untersuchen, die mit der Adipogenese verbunden sind. Diese Zellen stellen eine fibroblast-ähnliche Morphologie dar, die aber einmal zur Differenzierung angeregt wurde, und eine enzymatische Aktivierung, die mit der Fettsynthese und der Ansammlung von Triglyceriden einhergeht. Dies kann als morphologische Veränderungen beobachtet werden, um zytoplasmatische Lipidtröpfchen 34^,35zu produzieren. MCF10A ist eine nicht-tumormammäre Epithelzelllinie, die von einer prämenopausalen Frau mit einer fünflimafibrozystischen Erkrankung 36 abgeleitet wird. Es wurde für biochemische, molekulare und zelluläre Studien im Zusammenhang mit Säugetierkarzinogenese wie Proliferation, Zellmigration und Invasion verwendet. Die Ipithelzelllinie der Madin-Darby-Kaninchen-Niere (MDCK) wurde ausgiebig verwendet, um die Eigenschaften und molekularen Ereignisse zu untersuchen, die mit der Etablierung des epithelialen Phenotyps verbunden sind. Nach dem Erreichen des Zusammenflusses werden diese Zellen polarisiert und stellen Zellzelle-Klebstoffe, Eigenschaften des Säugetierepithelgewebes 37, her.

Um die Fähigkeit von AAS zu testen, die Zn-Werte in Säugetierzellen zu messen, analysierten wir ganze und subzelluläre Bruchteile (Cytosol und Kern) dieser fünf Zelllinien. AAS-Messungen zeigten unterschiedliche Konzentrationen von Zn in diesen Zelltypen. Die Konzentrationen waren bei der Vermehrung und Differenzierung der primären Myoblasten (4 bis 7 nmol/mg Eiweiß) geringer als bei den vier etablierten Zelllinien (von 20 bis 40 nmol/mg Eiweiß). Bei der Differenzierung von primären Myoblasten und Neuroblastom-Zellen im Vergleich zu den sich vermehrenden Zellen wurde ein kleiner, nicht signifikanter Anstieg des Zn-Niveaus festgestellt. Der gegenteilige Effekt wurde bei differenzierten Adipozyten festgestellt. Die sich vermehrenden 3T3-L1-Zellen wiesen jedoch im Vergleich zu den differenzierten Zellen höhere Konzentrationen des Metalls auf. Wichtig ist, dass in diesen drei Zelllinien die subzelluläre Fraktionierung zeigte, dass Zn je nach Stoffwechselzustand dieser Zellen differenziert im Zytosol und Kern verteilt ist. Bei der Vermehrung von Myoblasten, N2A-Zellen und 3T3-L1-Voradipozyten ist beispielsweise ein Großteil des Metalls auf den Kern lokalisiert. Bei der Induktion der Differenzierung durch spezifische Zellbehandlungen lokalisierte sich Zn in diesen drei Zelltypen auf das Zytosol. Interessanterweise zeigten beide epithelialen Zelllinien während der Proliferation höhere Konzentrationen von Zn im Vergleich zu beim Erreichen des Zusammenflusses, bei dem sich ein charakteristisches, enges Monolayer bildete. Bei sich vermehrenden Epithelzellen hatte die Säugetierzelllinie MCF10A eine gleichmäßige Zn-Verteilung zwischen Zytosol und Kern, während sich in der nierieabgeleiteten Zelllinie der größte Teil des Metalls im Zellkern befand. Bei diesen beiden Zelltypen, als die Zellen den Zusammenfluss erreichten, befand sich Zn vorwiegend bis zum Zytosol. Diese Ergebnisse zeigen, dass GF-AAS eine hochsensible und präzise Technik ist, um Elementaranalysen in ertragreichen Proben durchzuführen. GF-AAS gekoppelt mit subzellulärer Fraktionierung und kann angepasst werden, um die Ebenen von Spurenmetallelementen in verschiedenen Zelllinien und Geweben zu untersuchen.