Подготовка и применение нового бактериального биосенсора для предполагаемого обнаружения огнестрельных остатков
Summary
Протокол представлен с использованием методов синтетической биологии, чтобы синтезировать набор бактериальных биосенсоров для анализа остатков огнестрельных, и проверить функционирование устройств для их предполагаемого использования с помощью флуоресцентной спектроскопии.
Abstract
MicRoboCop является биосенсор, который был разработан для уникального применения в судебно-медицинской химии. MicRoboCop представляет собой систему из трех устройств, которые, при использовании вместе, может указывать на наличие огнестрельных остатков (ГСР), производя флуоресцентного сигнала в присутствии трех ключевых анализатов (сурьмы, свинца и органических компонентов ГСР). Протокол описывает синтез биосенсоров с использованием кишечной палочки (кишечная палочка) и аналитических методов химии, используемых для оценки селективности и чувствительности датчиков. Функционирование системы демонстрируется с помощью GSR, собранной из внутренней части отработавшего гильзы. После того как они подготовлены, биосенсоры могут храниться до тех пор, пока они не понадобятся, и могут быть использованы в качестве теста для этих ключевых анализаторов. Положительный отклик всех трех анализаторов обеспечивает предположительный положительный тест для ГСР, в то время как каждое отдельное устройство имеет приложения для обнаружения анализатора в других образцах (например, детектор для загрязнения свинцом в питьевой воде). Основным ограничением системы является время, необходимое для положительного сигнала; Будущая работа может включать изучение различных организмов для оптимизации времени отклика.
Introduction
Биосенсор — это любое аналитическое устройство, которое использует биологические компоненты (такие как белки, нуклеиновые кислоты или целые организмы), которые производят реакцию, которая может быть использована для обнаружения химического вещества или анализата. Например, угольная промышленность использовала биосенсор в течение большей части 20-го века для выявления наличия токсичных шахтных газов: канарейка в угольной шахте1. Реакция биологического организма (канарейки) (смерть или бедствие) на химический анализатор (окись углерода) наблюдалась шахтерами в целях защиты рабочих. В более современном и утонченном примере бактерии могут быть изменены с помощью синтетических методов биологии для реагирования на наличие определенного химического анализата, показывая конкретный ответ, например, выражение флуоресцентного белка.
Синтетическая биология является широкий термин, который относится к строительству биологических устройств и систем, которые не существуют, естественно, или ре-дизайн существующих биологических систем для конкретной цели2. Синтетическая биология отличается от генной инженерии стандартной методологией и существованием стандартизированных частей (стандартных синтетических генетических элементов биологии), которые могут быть использованы для синтеза устройств и систем. Часть вводится в геном устройства, такой организм, как бактерия, чтобы выразить определенную черту, которая послужит признаком функции. Например, во многих синтетических устройствах экспрессия флуоресцентного белка вводится в единый клеточный организм в качестве корреспондента белка. Несколько устройств могут быть объединены в систему. Геномов микроорганизмов, таких как бактерии легко манипулировать таким образом. Многочисленные примеры биосенсоров, специфических для широкого спектра химических анализаторов, были зарегистрированы в литературе за последнее десятилетие3,4.
В этой работе, система MicRoboCop представлена в качестве примера биосенсор разработан с использованием синтетических методов биологии с новыми приложениями в судебно-медицинской и экологической химии. MicRoboCop представляет собой систему из трех отдельных устройств, которые, в сочетании, позволит кишечной палочки , чтобы выразить красный флуоресцентный белок (ППП) в присутствии огнестрельных остатков (ГСР), который был собран из рук человека или поверхности. Каждое из трех устройств реагирует на конкретный химический анализатор, который, как известно, является компонентом GSR5. Три анализата, к которым реагирует система,-это I. 2, 4, 6-тритротолуол (ТНТ) и родственные соединения, II. свинца (в виде свинцо-ионов) и III. сурьмы (также в виде ионов).
ГСР состоит из множества различных химических веществ, но три обычно используются для идентификации остатков, поскольку GSR являются барием, свинцом и сурьмой5. Стандартным тестом доказательности для идентификации ГСР является использование сканирующей электронной микроскопии (РЭМ) с энергией диспергирующей рентгеновской флуоресценции (EDX)5. МДж-ЭДХ позволяет аналитикам идентифицировать уникальную морфологию и элементарные компоненты ГСР. В настоящее время есть несколько широко используются бинарные предположительные тесты доступны. Один недавно опубликованный предположительный тест использует Ion-мобильность спектроскопии (МСМ), который является специализированным оборудованием, которые не могут быть доступны во многих лабораториях6. Есть также несколько цветовых “точечные” тесты, которые могут быть использованы, хотя они, как правило, используются для определения расстояния или для идентификации GSR на пулевые отверстия и раны5. Дополнительно, было некоторое ограниченное внимание в литературе к электрохимическим испытаниям для GSR, которые используют волтамметрический анализ, который имеет преимущество потенциально быть полем портативным, или анодической зачистки волтамметрии, который является чрезвычайно чувствительный метод для металлических элементов7. Существует очень мало упоминается в литературе биосенсоров разработан специально для целей обнаружения ГСР, хотя некоторые биосенсоров для других судебно-медицинских заявок были опубликованы8.
Биологические элементы для каждого устройства в системе MicRoboCop и плазмированной конструкции проиллюстрированы на рисунке 1. Изогнутая стрелка в рисунке 1B представляет собой промоутер области, которая активируется в присутствии анализатора, овальные является рибосомальных связывания сайт, который позволяет перевод репортер белка, серый ящик с меткой ППП является ген, который выражает красный флуоресцентный белок, а красный восьмиугольник является прекращение транскрипции сайте. Все три устройства будут использоваться совместно в качестве системы для обнаружения GSR. Каждое устройство с определенным промоутером (SbRFP, PbRFP и ТНТ-ППП) будет инкубировали с образцом, который проходит испытания и флуоресценции ППП будут оцениваться. ППП будет выражен только если соответствующий химический анализатор присутствует и активирует промоутер региона. Были разработаны и представлены в этой работе три устройства, которые отвечают на некоторые химические вещества, присутствующие в ГСР.
Промоутеры, используемые в трех устройствах microbocop являются мышьяк и сурьмы чувствительных промоутер, sbrfp9,10, ведущий чувствительный промоутер, pbrfp11,12 и ТНТ чувствительный промоутер, ТНТ-ППП 13. потому что поиск в литературе выявлено не промоутер предназначен для реагирования на БАРИЙ, ТНТ промоутер был выбран вместо, так как этот промоутер чувствителен к ряду структурно связанных соединений (в частности, 2, 4-dinitrouene и динитобензола), которые, как известно, являются частью органических соединений, оставленных в ГСР. Этот промоутер успешно используется для специально обнаружить мельчайшие количества ТНТ и 2, 4-динитолуол (2, 4-DNT) в захороненных шахтах земли13. С помощью трех устройств вместе, как система, положительный тест на GSR будет производить флуоресценцию во всех трех устройствах. Флуоресцентное сигнала только в одном или двух устройствах будет указывать другой экологический источник анализатора (ы) или в случае промоутер ТНТ, активация соединения, которое не является органическим соединением, оставленному в GSR. С помощью всех трех устройств, возможность ложных положительных результатов из-за экологических источников сводится к минимуму. Свинец боеприпасов, который набирает популярность, по-прежнему составляет лишь около 5% от продажи боеприпасов в Соединенных Штатах; Следовательно, ложные отрицательные результаты из-за отсутствия свинца может быть возможность, но есть еще утилита в датчик, который использует свинец в качестве маркера для GSR14. В дополнение к этому конкретному судебно-медицинской заявке, каждое устройство может быть использовано отдельно для целей обнаружения загрязняющих веществ в окружающей среде.
Представленные протоколы включают в себя синтетические методы биологии, используемые для создания устройств (сенсорных бактерий) и аналитических методов, чтобы проверить функцию устройств и проанализировать флуоресцентных сигналов, полученных. Протокол также включает в себя сбор вещественных доказательств в виде ручного протирания для сбора ГСР из рук подозреваемого или Швабинга для сбора ГСР с поверхности. Результаты с устройства ведущего датчика приведены в качестве примера результатов, а также демонстрация положительного теста для GSR с использованием отработавшего гильзы.
Protocol
Representative Results
Discussion
Модификации и устранение неполадок
Эксперимент, описанный в таблице 4 , может быть изменен любым способом, подходящим для разработанных датчиков. Наиболее важным аспектом химического датчика является оценка его чувствительности и специфичности. Это в?…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Авторы хотели бы отметить студентов в университете Лонгвуд в BIOL 324 (генетика) и студентов в хим 403 (Расширенный решение проблемы химической лаборатории), которые были вовлечены в первоначальную подготовку и тестирование биосенсоров сурьмы и свинца. Идея MicRoboCop была задумана на GCAT SynBIO семинар (лето 2014), который финансируется ННФ и Говард Хьюз медицинский институт и организовано в университете штата Мэриленд Балтимор County. Авторы также признают финансирование, полученное от университета Лонгвуд Кук-Коул колледжа искусств и наук и GCAT SynBio выпускников Грант.
Materials
| 1,3-dinitrobenzene, 97% | Aldrich | D194255-25G | |
| 2,4-dinitrotoluene, 97% | Aldrich | 101397-5G | |
| Agar | Fisher Scientific | BP1423-500 | |
| Ampicillin | Fisher Scientific | BP1760-5 | |
| Antimony, Reference Standard Solution (1000ppm ±1%/Certified) | Fisher Scientific | SA450-100 | Standard in dilute HNO3 |
| Cut Smart Buffer | New England BioLabs | B7204S | |
| Duplex Buffer | Integrated DNA Technologies | 11-01-03-00 | |
| EcoRI-HF Restriction Enzyme | New England BioLabs | R3101S | |
| Ethanol, HPLC grade, denatured | Acros Organics | AC611050040 | Solvents do not need to be HPLC grade, ACS or reagent grade will work. |
| Eurofins Genomics SimpleSeq DNA Sequencing Kits | Eurofins Genomics | SimpleSeq Kit Standard | |
| Forward primer for colony PCR | Integrated DNA Technologies | 5’- GCCGCTTGAATTCGTCATATAT-3’ | |
| Forward primer for DNA sequencing | Integrated DNA Technologies | 5’- GTAAAACGACGGCCAGTG-3’ | |
| IBI Science High Speed Plasmid Mini-kit | IBI Scientific | IB47101 | |
| LB Broth, Miller | Fisher Scientific | BP1426-500 | |
| Lead, Reference Standard Solution (1000ppm ±1%/Certified) | Fisher Scientific | SL21-100 | Standard in dilute HNO3 |
| LeadOff Disposable Cleaning and Decon Wipes | Hygenall | 45NRCN | Sold in canisters or individually wrapped, any alcohol based wipe will work. |
| Methanol, HPLC grade | Fisher Scientific | A452-4 | Solvents do not need to be HPLC grade, ACS or reagent grade will work. |
| NEB 5-alpha Competent E. coli cells | New England BioLabs | C2987I | |
| NheI-HF Restriction Enzyme | New England BioLabs | R3131S | |
| Nuclease free water | New England BioLabs | B1500S | |
| OneTaq 2X Master Mix with Standard Buffer | New England BioLabs | M0482S | |
| Plasmids from the registry of standard biological parts used for synthetic biology | Registry of Standard Biological Parts | http://parts.igem.org/Main_Page | |
| Promoter Sequences | Integrated DNA Technologies | Sb promoter: 5’-GCATGAATTCAGTCAT ATATGTTTTTGACTTATCCGCTTCGAAGAGAG AGACACTACCTGCAACAATCGCTAGCGCAT-3’ 3’-CGTACTTAAGCTCACTATATACAAAAACT GAATAGGCGAAGCTTCTCTCTCTGTGATGGAC GTTGTTAGCGATCGCGTA-5’ Pb promoter: 5’-GCATGAATTCGTCTTG ACTCTATAGTAACTAAGGGTGTATAATCGGCA ACGCGAGCTAGCGCAT-3’ 3’-CGTACTTAAGCAGAACTGAGATATCATTG ATCTCCCACATCTTAGCCGTTGCGCTGCGATCGCGTA-5’ TNT promoter: 5’GCATTCTAGATCAATT TATTTGAACAAGGCGGTCAATTCTCTTCGATT TTATCTCTCGTAAAAAAACGTGATACTCATCA CATCGACGAAACAACGTCACTTATACAAAAAT CACCTGCGAGAGATTAATTGAATTCGCAT3’ 3’CGTAAGATCTAGTTAAATAAACTTGTTCCG CCAGTTAAGAGAAGCTAAAATAGAGAGCATTT TTTTGCACTATGAGTAGTGTAGCTGCTTTGTT GCAGTGAATATGTTTTTAGTGGACGCTCTCTA ATTAACTTAAGCGTA5’ |
|
| Reverse primer for colony PCR | Integrated DNA Technologies | 5’- GCCGCTTGAATTCGTCTAGACT- 3’ | |
| Reverse primer for DNA sequencing | Integrated DNA Technologies | 5’- GGAAACAGCTATGACCATG-3’ | |
| T4 DNA Ligase | New England BioLabs | M0202S |
Referenzen
- Eschner, K. "The Story of the Real Canary in the Coal Mine.". The Smithsonian Magazine. , (2016).
- Roda, A., et al. Progress in chemical luminescence-based biosensors: A critical review. Biosensors & Bioelectronics. 76, 164-179 (2016).
- He, W., Yuan, S., Zhong, W. H., Siddikee, M. A., Dai, C. C. Application of genetically engineered microbial whole-cell biosensors for combined chemosensing. Applied Microbiology and Biotechnology. 100 (3), 1109-1119 (2016).
- Dalby, O., Butler, D., Birkett, J. W. Analysis of Gunshot Residue and Associated Materials-A Review. Journal of Forensic Sciences. 55 (4), 924-943 (2010).
- Bell, S., Seitzinger, L. From binary presumptive assays to probabilistic assessments: Differentiation of shooters from non-shooters using IMS, OGSR, neural networks, and likelihood ratios. Forensic Science International. 263, 176-185 (2016).
- O'Mahony, A. M., Wang, J. Electrochemical Detection of Gunshot Residue for Forensic Analysis: A Review. Electroanalysis. 25 (6), 1341-1358 (2013).
- Vigneshvar, S., Sudhakumari, C. C., Senthilkumaran, B., Prakash, H. Recent Advances in Biosensor Technology for Potential Applications – An Overview. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 4, 9 (2016).
- Fernandez, M., Morel, B., Ramos, J. L., Krell, T. Paralogous Regulators ArsR1 and ArsR2 of Pseudomonas putida KT2440 as a Basis for Arsenic Biosensor Development. Applied and Environmental Microbiology. 82 (14), 4133-4144 (2016).
- Porter, S. E. G., Barber, A. E., Colella, O. K., Roach, T. D. Using Biological Organisms as Chemical Sensors: The MicRoboCop Project. Journal of Chemical Education. 95 (8), 1392-1397 (2018).
- Borremans, B., Hobman, J. L., Provoost, A., Brown, N. L., Van der Lelie, D. Cloning and functional analysis of the pbr lead resistance determinant of Ralstonia metallidurans CH34. Journal of Bacteriology. 183 (19), 5651-5658 (2001).
- Hobman, J. L., Julian, D. J., Brown, N. L. Cysteine coordination of Pb(II) is involved in the PbrR-dependent activation of the lead-resistance promoter, PpbrA, from Cupriavidus metallidurans CH34. Bmc Microbiology. 12, (2012).
- Yagur-Kroll, S., Amiel, E., Rosen, R., Belkin, S. Detection of 2,4-dinitrotoluene and 2,4,6-trinitrotoluene by an Escherichia coli bioreporter: performance enhancement by directed evolution. Applied Microbiology and Biotechnology. 99 (17), 7177-7188 (2015).
- Gorman, M. "Guns in America: The Debate Over Lead Based Bullets.". Newsweek. , (2017).
- Yuksel, B., Ozler-Yigiter, A., Bora, T., Sen, N., Kayaalti, Z. GFAAS Determination of Antimony, Barium, and Lead Levels in Gunshot Residue Swabs: An Application in Forensic Chemistry. Atomic Spectroscopy. 37 (4), 164-169 (2016).
- Blakey, L. S., Sharples, G. P., Chana, K., Birkett, J. W. Fate and Behavior of Gunshot Residue-A Review. Journal of Forensic Sciences. 63 (1), 9-19 (2018).
- Yagur-Kroll, S., et al. Escherichia coli bioreporters for the detection of 2,4-dinitrotoluene and 2,4,6-trinitrotoluene. Applied Microbiology and Biotechnology. 98 (2), 885-895 (2014).
