기능 리포터 시스템으로 특정 진 균의 오 번역 비율 측정

분자 생물학에 있는 정보의 흐름은 기능적인 단백질에 유전 정보의 번역을 요구 합니다. 모든 생물학 시스템과 마찬가지로, 유전자 번역도 측정 가능한 오류를 수반 합니다. 번역 오류 비율의 추정치는 통상적으로 코 돈 당 약 1/10000으로 인용 된다 (리 바스 드 푸 플 라 나 외.¹). 그러나, 오차 율은 10^-5 미만에서 0.05/코 돈^1,2,³,⁵미만까지 매우 다양 하다. 3 개 이상의 차수에 걸친 광범위 한 오차 율은 변환 경로의 여러 단계에서 오류가 발생할 수 있다는 사실 때문입니다. 아미노 아실 화⁶ 에서의 확률, 돌연변이 또는 스트레스 유발 오류 ^{7 , 8 , 9 ,} ( ¹⁰) asparaginyl 및 glutaminyl-trnas⁵또는 리보솜 디코딩 오류에 대 한 생리 적 미 실릴 화 방법. 0.01/코 돈을 나타내는 매우 높은 오류율은 변환 오류가 생리 적 기능^1,12 를 수행 할 수 있으며 그 오 번역은 문맥 별¹³일 수 있다고 제안 했습니다.

우리와 다른 사람들은 유전자 번역에서 자연적으로 발생 하는 오류가 특히 환경적 스트레스에 적응 하는 것으로 나타났습니다.^1,5,12,14,^{15 ,18}. 마이 코 박테리아에서, 2 단계 간접 글루타민/아스파라긴 trna 아미노 실릴 화 경로¹⁹에서 발생 하는 오류,²⁰ 은 1 차 항 결핵 항생제 리 famp신과 대 한 현저 하 게 증가 된 내성을 초래 ⁵. 따라서, 우리는 작은 분자로 진 균의 오 번역을 감소 시키는 것이 rifampicin에 의해 죽이는 약효를 줄 수 있다고 추측 했습니다. 우리는 자연적으로 발생 하는 아미노 글 리코 시드를 확인 하 고, 마이 박테리아의 오 번역을 감소 시킬 수 있는 화합물로 서, 시험관 내 및 생체 내에서의 진 균을 죽이는 리페 라이 신-매개 하 고,이를 제한 하 고 세계에서 가장 치명적인 병원 체 인 결핵²² 의 글로벌 통제력을 위협 하는 리 프 람 신 저항성²¹의 출현.

번역 오류를 연구 하기 위해, 오 변환 측정 방법을 사용 해야 합니다. 오 번역의 측정을 위해 개발 된 여러 방법이 있다, 각각 장점과 단점. 간단히 말해서, 정밀 질량 분석 법 기반 방법에는 여러 가지 이점이 있으며, 그 중 가장 중요 한 것은 여러 유형의 변환 오류를 감지 하는 새로운 알고리즘을 사용 하면, 상대적으로 공정한 오 번역 측정이 가능 수행¹⁸. 그러나, 질량 분 광 법은 오류가 발생 하기 쉬운 간접적인 tRNA 아미노 아실 화 통로 때문에 마이 코 박테리아에서 발생 하는 미 란도 증의 유형을 정확 하 게 하는 탈 아 미드 화 사건의 측정을 위해 아주 적당 하지 않습니다. 이는 질량 분 광 법 (²³)에 대 한 샘플의 처리에서 발생 하는 고주파 비 효소 적 탈 아 미드 화 때문에, 매우 높은 배경 신호를 초래 한다. 따라서,이 통로에 있는 과실의 탐지를 위해, 유전 이득 기능 기자는 명백한 이득을 제안 합니다. 특히 적절 한 기능 향상 기자는 배경 비율이 매우 낮아 매우 낮은 오류율¹¹을 측정할 수 있습니다.

병원 성 진 균 결핵 으로 실험을 수행 하기 위해서는 전문 시설과 추가 예방 조치가 필요 하므로 비 병원 성 진 균 m. smegmatis 에서 대부분의 실험을 수행 하 고 이전에 두 종 사이의 결과는 광범위 하 게 비교 된다^5,21. 간접 tRNA 아미노 아실 화 통로에 의해 생성 된 마이 코 박테리아에서의 오 번역 속도를 측정 하기 위해, 우리는 대장균에서 리보솜 디코딩 오류를 측정 하기 위해 이전에 개발 된 Renilla반딧불 이중 루시퍼 라 제 시스템을 수정 했습니다 . ¹¹ . 진 균에 사용 하십시오. 우리는 3 개의 특정 한 수정을 했습니다: 원래 리포터가 진 균을 효율적으로 표현 하지 않았기 때문에, 서 열이 코 돈에 최적화 되었고, 루시퍼 라 제의 C-말단 3 개의 아미노산이 반딧불이 라 리 신-류 신- 일부 시스템 (²⁴)에서 인신 매매 신호로 서 주석이 추가 되 고, 이소류신-알라닌-발 린 (²⁵)으로 변형 되었다. 원래 리포터는 루시퍼 라 제 돌연변이가 있는 반딧불의 중요 한 리 신 잔류물을 가졌다. 대신, 우리는 심각 하 게 보존 된 아 스 파르테 이트 (D120) 또는 글루타민 산 염 (E144) 잔류물을 각각 아스파라긴 및 글루타민에 각각²⁵ (그림 1)로 돌연변이 시켰다. 리포터는에 피 솜 테 트 라 사이 클린-유도성 플라스 미드 pUV-tetOR에 클로닝 되었다 ( 재료 표참조). 함수 성 기자는 효소/형광 단백질에 심각 하 게 보존 된 기능 잔류물을 돌연변이 하 여 작동 하지 않습니다^11,26. 단백질의 기능적 변형을 합성 하는 번역 (또는 이론적으로 전사) 오류는 변환 된 단백질의 서브셋에서 측정 가능한 효소 활성을 초래할 것 이다. 단백질 풍부의 변화를 교정 하기 위해, 돌연변이 리포터는 벤치 마크로 작용 하는 기능적 단백질과 함께 공동 발현 되며, 기능¹¹의 이득에 대 한 정확한 정량화를 가능 하 게 합니다. Renilla반딧불 듀얼 루시퍼 라 제 리포터는 특정 한 마이 박테리아의 오 번역 률^5,25 (그림 2 와 섹션 1)를 정확 하 게 측정할 수 있었지만, 신속 하 게 미 번역 속도를 바꾸는 분자의 중/고 처리량 스크리닝에는 적합 하지 않다는 것을 깨달았습니다. 이것은 주로 두 가지 이유, 즉 a) Renilla 루시퍼 라 제의 효능의 상대적인 부족은 미 역 율을 측정 하기 위해 최소 1 mL의 진 균 배양/시료가 필요 하 고 b) 전에 세포의 용 해에 대 한 요구 사항을 의미 합니다 과도 한 수동 처리에 필요한 효소 활성 측정: 진 균 세포는 두껍고 다층의 세포 벽과 용 해에 상대적으로 저항성이 있는 외피를가지고 있습니다. 따라서 우리는 작은 부피 (예를 들어, 96 웰 플레이트 시스템)에서 사용할 수 있고 측정을 위해 세포 용 해를 필요로 하지 않았던 새로운 함수 이득 리포터 시스템을 개발 하고자 했습니다. 우리는 매우 강력한 Nluc 루시퍼 라 제를 사용 하 고 아스파라긴로 돌연변이 할 때 2 개의 로그 기능 손실이 발생 하는 중요 한 아 스 파르테 이트 잔류물을 확인 했습니다 (그림 1). 더욱이, Nluc의 작은 크기는 Nluc가 배양 상층 액으로 분 비 되는 것을 허용 하 고이에 대 한 요구 사항을 회피 할 수 있도록 하는, 진 균²⁷ 의 주요 분 비가 있는 항 원 인 85A에서 N-말단 분 지 신호 태그를 갖도록 허용 세포 용 해. 벤치 마크 단백질 인 GFP는 돌연변이 된 Nluc와 동일한 프로모터 로부터 발현 되었으나 통합 된 벡터 로부터 ( 물질의 표를 참조), 온전한 세포 (도321)에서 측정 될 수 있었다. 이러한 장점에도 불구 하 고, Nluc/GFP 리포터 (프로토콜의 섹션 2)에는 또한 단점이 있다: D140N 돌연변이에의 한 Nluc 활성 (100 배)에서 비교적 겸손 한 감소는 극히 낮은 오 번역 속도의 측정을 허용 하지 않을 것 이며, 리포터를 번역 오류의 정확한 측정 보다 스크리닝 도구로 더 적합 하 게 만들기. 또한, Nluc에는 중요 한 글루타민 산 염 잔기가 없습니다. 따라서 아스파라긴-아스파라긴 오류율만 측정 될 수 있습니다. 이 작품에서 설명 하는 일반적인 원칙 연구자 중 하나를 사용 하 여 이러한 기자를 허용 한다 또는 수정 기자는 그들의 모델 시스템에서 다른 특정 번역 오류 비율의 정확 하 고/또는 간편한 측정에 대 한 적절 한. 선택.