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Immunologie und Infektion

Mesure de taux de Détraduction mycobactériens spécifiques avec des systèmes de reporter à gain de fonction

Published: April 26, 2019
doi:
10.3791/59453
, , ,
1Centre for Global Health and Infectious Diseases, Collaborative Innovation Centre for the Diagnosis and Treatment of Infectious Diseases,Tsinghua University School of Medicine

Summary

Dans cet article, nous présentons deux méthodes complémentaires pour mesurer des taux spécifiques d’erreur translationnelle et de mauvaise traduction dans le modèle Mycobacterium, Mycobacterium smegmatis, en utilisant des systèmes de reporter de gain de fonction. Les méthodes peuvent être employées pour mesurer des taux d’erreur précis dans le faible débit ou les taux d’erreur relatifs dans un réglage plus haut débit.

Abstract

La traduction des gènes en protéines est sujette à des erreurs. Bien que le taux moyen d’erreur translationnelle dans les systèmes modèles soit estimé à 1/10000 par codon, les taux d’erreur réels varient grandement selon l’espèce, l’environnement et les codons étudiés. Nous avons déjà montré que les mycobactéries utilisent une voie en deux étapes pour la génération de tRNAs d’asparagine et de glutamine aminoacylées et que cela est spécifiquement associé à des taux d’erreur relativement élevés en raison de la modulation des taux de mauvaise traduction par un composante essentielle de la voie, l’amidotransférase GatCAB. Nous avons modifié un système de double luciférase Renilla-Firefly précédemment employé qui avait été utilisé pour mesurer les taux de mauvaise traduction chez Escherichia coli pour utilisation dans les mycobactéries pour mesurer des taux de mauvaise traduction spécifiques du glutamate à la glutamine codons et aspartate pour les codons d’asparagine. Bien que ce système de reporter était adapté à l’estimation exacte des taux d’erreur spécifiques, le manque de sensibilité et les exigences pour les étapes de manipulation excessive fait qu’il n’est pas adapté pour les applications à haut débit. Par conséquent, nous avons développé un deuxième système de reporter de gain de fonction, utilisant nluc luciférase et la protéine fluorescente verte (GFP), qui est plus propice aux paramètres de débit moyen/élevé. Nous avons utilisé ce système pour identifier la kasugamycine comme une petite molécule qui peut diminuer la mauvaise traduction des mycobactéries. Bien que les reporters que nous décrivons ici ont été utilisés pour mesurer des types spécifiques de fausse traduction mycobactérienne, ils peuvent être modifiés pour mesurer d’autres types de mauvaise traduction dans un certain nombre de systèmes modèles.

Introduction

La circulation de l’information en biologie moléculaire nécessite la traduction de l’information génétique en protéines fonctionnelles. Comme pour tous les systèmes biologiques, la traduction génique implique également des erreurs mesurables. Les estimations des taux d’erreur dans la traduction sont généralement citées comme étant d’environ 1/10000 par codon (révisé par Ribas de Pouplana et al.1). Cependant, les taux d’erreur varient considérablement, de moins de 10-5 à plus de 0,05/codon1,2,3,4,5. Le large éventail de taux d’erreur, couvrant plus de trois ordres de grandeur, est dû au fait que des erreurs peuvent résulter de plusieurs étapes dans la voie de traduction: des erreurs stochastiques, mutationnelles ou induites par le stress dans l’aminoacylation6, le 7 , le 8 , le 9 , 10, misacylation physiologique de l’asparaginyl-et du glutaminyl-tRNAs5, ou erreurs de décodage ribosomique2,3,11. Des taux d’erreur mesurablement élevés, représentant plus de 0,01/codon, suggèrent que les erreurs translationnelles peuvent exécuter des fonctions physiologiques1,12 et que la mauvaise traduction peut être spécifique au contexte13.

Nous et d’autres avons montré que des erreurs naturelles dans la traduction génique peuvent être adaptatives, surtout pendant les contraintes environnementales1,5,12,14,15,16 ,17,18. Chez les mycobactéries, les erreurs générées par la voie de l’aminoacylation de la glutamine/asparagine indirecte en deux étapes19,20 entraînent une tolérance remarquablement accrue pour la rifampicine de la première ligne de l’antibiotique antituberculeux 5. par conséquent, nous avons spéculé que la diminution de la fausse traduction mycobactérienne avec une petite molécule peut potentier le massacre par la rifampicine. Nous avons examiné et identifié la kasugamycine d’aminosides naturelle comme un composé qui pourrait diminuer la mauvaise traduction mycobactérienne, potentier la mise à mort médiée par la rifampicine des mycobactéries à la fois in vitro et in vivo21, et limiter la l’émergence de la résistance à la rifampicine21, qui menace le contrôle global de la tuberculose22 — le pathogène le plus mortel au monde.

Pour étudier l’erreur translationnelle, les méthodes de mesure de la mauvaise traduction doivent être employées. Il existe plusieurs méthodes qui ont été développées pour la mesure de la mauvaise traduction, chacune avec des avantages et des inconvénients. Brièvement, les méthodes basées sur la spectrométrie de masse de précision ont plusieurs avantages, dont la plus importante est que, avec des algorithmes plus récents pour la détection de plusieurs types d’erreur translationnelle, une mesure relativement impartiale de la mauvaise traduction peut être effectué18. Cependant, la spectrométrie de masse n’est pas très appropriée pour la mesure des événements de déconversion de la désamidation — précisément le type de mauvaise traduction qui se produit dans les mycobactéries en raison de la voie indirecte d’aminoacylation de tRNA sujette aux erreurs. C’est en raison de la déamidation non enzymatique à haute fréquence qui se produit dans le traitement des échantillons pour la spectrométrie de masse23, ce qui entraîne un signal d’arrière-plan extrêmement élevé. Par conséquent, pour la détection des erreurs dans cette voie, les journalistes de gain de fonction génétique offrent des avantages distincts. Plus précisément, les rapporteurs de gain de fonction appropriés peuvent avoir des taux d’arrière-plan extrêmement bas, permettant la mesure des taux d’erreur très bas11.

Étant donné que la réalisation d’expériences avec Mycobacterium tuberculosis pathogène nécessite des installations spécialisées et des précautions supplémentaires, nous effectuons la plupart des expériences dans la Mycobacterium M. smegmatis non pathogène — et avons montré plus tôt que les résultats entre les deux espèces sont globalement comparables à5,21. Pour mesurer les taux de mauvaise traduction dans les mycobactéries générées par la voie indirecte de l’aminoacylation de la tRNA, nous avons modifié un système de double luciférase Renilla-Firefly qui avait été précédemment développé pour mesurer les erreurs de décodage ribosomique chez E. coli 11 pour une utilisation dans les mycobactéries. Nous avons fait trois modifications spécifiques: le reporter original n’a pas exprimé efficacement dans les mycobactéries, et par conséquent, la séquence a été codon-optimisé, et le C-terminal trois acides aminés de la luciférase Firefly, sérine-lysine-leucine, qui a été annotée comme signal de trafic dans certains systèmes24, a été modifiée en isoleucine-alanine-valine25. Le reporter original avait un résidu de lysine critique dans la luciférase Firefly mutated. Au lieu de cela, nous avons muté soit un résidu d’aspartate (D120) ou de glutamate (E144) conservé de façon critique dans la luciférase de Renilla à l’asparagine et à la glutamine, respectivement25 (figure 1). Le reporter a été subcloné dans le pUV-tetOR (voir le tableau des matériaux) dans le plasmide à tétracycline-inducible. Les reporters à gain de fonction mutent des résidus fonctionnels conservés de façon critique dans les enzymes/protéines fluorescentes qui les rendent non fonctionnels11,26. Les erreurs translationnelles (ou théoriquement, transcriptionnelles) qui synthétisent la variante fonctionnelle de la protéine résulteraient en une activité enzymatique mesurable dans un sous-ensemble de protéines traduites. Pour corriger la variation de l’abondance des protéines, le reporter muté est coexprimé avec une protéine fonctionnelle qui agit comme une référence et permet une quantification précise du gain de fonction11. Alors que le reporter de Renilla-Firefly Dual-luciférase permettait de mesurer précisément les taux de détraduction mycobactériens spécifiques5,25 (figure 2 et section 1 du protocole), nous avons rapidement s’est rendu compte qu’il ne convient pas pour le criblage à moyen/haut débit de molécules qui modifieraient le taux de mauvaise traduction. Ceci est dû principalement à deux raisons, à savoir a) le manque relatif de puissance de Renilla luciférase signifiait qu’un minimum de 1 ml de culture/échantillon de mycobactériens était nécessaire pour mesurer les taux de mauvaise traduction, et b) l’exigence de la lyse des cellules avant à la mesure de l’activité enzymatique nécessitaient une manipulation manuelle excessive: les cellules mycobactériennes ont une paroi cellulaire épaisse et multicouche et une enveloppe relativement résistante à la lyse. Par conséquent, nous avons cherché à développer un nouveau système de reporter de gain de fonction qui pourrait être utilisé avec de petits volumes (p. ex., dans un système de plaques à 96 puits) et ne nécessitait pas de lyse cellulaire pour les mesures. Nous avons utilisé la luciférase de Nluc très puissante et identifié un résidu d’aspartate critique qui, lorsqu’il est muté en asparagine, a entraîné une perte de fonction de 2 billes (figure 1). En outre, la petite taille de Nluc lui a permis d’avoir une balise de signal de sécrétion N-terminale — de l’antigène 85A, un antigène sécrété majeur dans les mycobactéries27 — qui permettrait à nluc d’être sécrété dans la culture surnageant et de contourner l’exigence de la lyse cellulaire. La protéine de référence, GFP, a été exprimée par le même promoteur que le Nluc muté, mais à partir d’un vecteur intégré (voir le tableau des matériaux), et pourrait être mesurée dans les cellules intactes21 (figure 3). Malgré ces avantages, le journaliste Nluc/GFP (section 2 du protocole) a également des inconvénients: la réduction relativement modeste de l’activité de Nluc (100 fois) avec la mutation D140N ne permettrait pas de mesurer des taux d’erreur de traduction extrêmement faibles, rendant le reporter plus approprié comme outil de dépistage que pour les mesures exactes de l’erreur translationnelle. De plus, Nluc n’a pas de résidus de glutamate critiques; par conséquent, seuls les taux d’erreur d’asparagine à aspartate pourraient être mesurés. Les principes généraux décrits dans ce travail devraient permettre aux chercheurs d’utiliser ces reporters comme nous l’avons fait ou de modifier les journalistes selon les besoins pour une mesure précise et/ou facile d’autres taux d’erreur translationnel spécifiques dans leur système modèle de choix.

Protocol

1. Renilla-Firefly Dual-luciférase reporter Remarque: Pour une représentation visuelle de cette méthode, voir la figure 2. Ensemencez des souches de reporter mycobactériens de-80 ° c avec 2 mL de 7H9 de moyenne. La double luciférase sauvage, ainsi que les souches muté Renilla (reporter), doivent être utilisées pour permettre le calcul des taux de mauvaise traduction (Voir l’étape 1,7). Agiter à 37 ° c pendant 1 à 2 jours jusqu’à ce que la OD600 atteigne la phase stationnaire (OD > 3). Aliquot et diluer à OD600nm autour 0,1-0,5. Pour les expériences typiques, utilisez trois cultures biologiques répliquées indépendantes. L’anhydrotétracycline (ATC), un inducteur analogue de la tétracycline de l’expression reporter (qui est contrôlé par un promoteur inductible par la tétracycline) jusqu’à une concentration finale de 50 ng/mL. Pour mesurer les effets de la kasugamycine sur les taux de mauvaise traduction21, ajouter différentes doses de kasugamycine à la culture (voir la figure 4 pour les doses indiquées) en même temps (aux doses testées, la kasugamycine n’a pas d’activité antimicrobienne). Notez qu’il est important d’inclure au moins un contrôle non induit pour chaque reporter. Culture-induisent des cultures pour 4-6 h à 37 ° c avec agitation. Transférer les cultures bactériennes dans un tube de 2 mL, et centrifuger à 3 220 x g pendant 5 min à température ambiante pour pellets vers le bas les bactéries. Jetez le surnageant. Perturber les bactéries en ajoutant 40 μL de tampon de lyse passif 1x (fourni par un kit de double luciférase), qui a été dilué (1:1) dans de l’eau à double distillation. Transférer le lysat bactérien resuspendu à une plaque de 96-puits blanche, un puits par échantillon, et agiter à température ambiante pendant 20 min.Attention: Ne pas trop Incuber les bactéries dans le tampon de lyse (pendant plus de 30 min). Ajouter 80 μL de substrat de lucioles à chaque puits, agiter pendant 15 s et mesurer la luminescence par luminomètre avec 1 000 MS comme temps d’intégration. Utilisez soit un injecteur automatisé, soit une pipette multicanaux pour éviter les erreurs de pipetage. Ajouter 80 μL de substrat de Renilla à chaque puits, agiter pendant 15 s et mesurer la luminescence par luminomètre avec 1 000 MS comme temps d’intégration. Soustraire la luminescence de fond-mesurée à l’aide de M. smegmatis de type sauvage (c.-à-d., ne contenant pas de Reporters) ou de lysat de reporter non induit-à partir des valeurs mesurées. Utilisez les valeurs corrigées pour calculer les taux de mauvaise traduction de chaque condition en utilisant l’équation suivante11,25, où DN fait référence à l’activité dans la souche de reporter muté: 2. nluc/GFP reporter Remarque: Pour une représentation visuelle de cette méthode, voir la figure 3. Ensemencez la souche de reporter bactérienne de-80 ° c avec 2 mL de milieu 7H9. Agiter à 37 ° c pendant 1 à 2 jours jusqu’à ce que la OD600 atteigne la phase stationnaire (OD > 3). Sous-culture à 50 mL de milieu 7H9 et croître jusqu’à ce que la OD600 atteigne la phase stationnaire tardive (> 4). Avant d’aliciter les bactéries à une plaque de 96 puits, ajouter l’ATC à une concentration finale de 50 ng/mL et bien mélanger. L’induction de la culture en vrac garantit que tous les puits contiennent la même quantité d’inducteur et que l’induction du reporter est synchronisée. Aliquot la bactérie à une plaque de puits de 96 à fond clair, avec 100 μL de volume dans chaque puits. Pour l’écran pour les petites molécules affectant les taux de mauvaise traduction, ajoutez le composé à la concentration indiquée pour sélectionner des puits. Aux fins du présent protocole, utiliser la kasugamycine (aux doses indiquées à la figure 5) comme illustration. Ajouter différentes doses de kasugamycine pour sélectionner des puits (chaque groupe expérimental doit contenir au moins deux réplicats biologiques). Agiter et induire les échantillons à 37 ° c pendant 16-20 h.Remarque: Il est nécessaire de sceller la plaque avec le film. En outre, tous les puits de bord doivent être remplis avec au moins 200 μL d’eau stérile pour limiter l’évaporation des puits d’essai. Prélever 80 μL de chaque puits, à l’aide d’une pipette multicanaux, et transférer les échantillons vers une plaque de 96-puits noire (qui maximise la mesure du signal de fluorescence). Mesurez le signal GFP par luminomètre avec 20 ms comme temps d’intégration. Après avoir mesuré le signal GFP, centrifuger la plaque à 3 220 x g pendant 10 min. transférer 50 μl du surnageant sur une plaque de 96 puits à fond blanc (qui maximise la mesure du signal de luminescence), ajouter 50 μl de substrat de nluc à chaque puits, les mélanger bien, et mesurer la luminescence par luminomètre avec 1 000 MS comme temps d’intégration. Déterminer le ratio Nluc/GFP en divisant les valeurs corrigées de luminescence de Nluc par fluorescence du GFP: cette mesure (en unités arbitraires) est une mesure relative de l’aspartate pour la détraduction de l’asparagine.

Representative Results

Une caricature illustrant le contour général des deux systèmes de reporter utilisés dans ce travail est illustrée à la figure 1. Une vue d’ensemble de la section 1 du protocole est illustrée à la figure 2 et une vue d’ensemble de la section 2 de la figure 3. L’effet de la kasugamycine sur la fausse traduction mycobactérienne est illustré à la figure 4, mesurée par le système reporter Renilla-Firefly. Pour montrer la spécificité de l’action kasugamycine, le reporter a également été exprimé dans une souche de M. smegmatis dans laquelle la Ksga a été supprimée (∆ Ksga). KsgA est une rRNA diméthyl transférase, et les souches de Ksga-Deleted sont relativement résistantes à la kasugamycine. L’action de kasugamycine sur la mauvaise traduction a également été mesurée à l’aide du reporter Nluc/GFP, comme le montre la figure 5. Figure 1 : Dessin animé illustrant les deux systèmes de reporter de gain de fonction. (A) le système de reporter Renilla-Firefly est composé de deux enzymes de luciférase exprimées en protéine de fusion et sous le contrôle d’un promoteur inductible par la tétracycline. L’expression de l’enzyme double de type sauvage entraîne une activité mesurable élevée des LUCIFERASES Renilla et Firefly (en haut). La mutation d’un résidu d’aspartate critique, D120, en Renilla à l’asparagine rend l’enzyme Renilla (D120N) inactive, mais luciférase luciole est toujours active. Une mauvaise traduction de l’asparagine à l’aspartate (dans ce cas, de la physiologiquement misacylée ASP-tRNAASN tRNA5,21) entraîne une faible proportion des protéines Renilla traduites qui gagnent de l’activité, qui peut être mesurée. La comparaison de l’activité Renilla/Firefly du reporter muté par rapport à l’enzyme double de type sauvage permet le calcul de l’asparagine à un taux de mauvaise traduction de l’aspartate. B) le système de rapporteurs nluc/GFP fonctionne selon un principe similaire. Le gène muté de Nluc (D140N) a un signal de sécrétion N-terminale dérivé de l’antigène 85A, une protéine mycobactérienne sécrétée majeure. Les gènes nluc et GFP sont exprimés à partir de promoteurs inductibles de tétracycline identiques, pour permettre l’utilisation de GFP comme référence d’expression relative. Notez l’absence de souche de contrôle de type sauvage de Nluc: ce reporter est principalement utilisé dans le dépistage, où les mesures des taux relatifs de mauvaise traduction sont suffisantes pour l’écran principal. S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre. La figure 2 : Aperçu de la mesure du taux d’erreur de traduction en utilisant Renilla-Firefly reporter (section 1 du protocole). Des cultures fraîches de M. smegmatis, transformées avec un plasmide exprimant les reporters à double luciférase, sont cultivées. L’expression de reporter est induite, et les composés expérimentaux ou les conditions sont testés. Après 4-6 h d’expression de reporter, les cultures sont granulées et lysées et les lysats sont testés pour l’activité de la double luciférase. S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre. Figure 3 : Aperçu de la mesure du taux d’erreur de traduction Nluc-GFP reporter (section 2 du protocole). Une culture fraîche de M. smegmatis, transformée avec les reporters NLUC et GFP, est cultivée à un volume suffisant pour toutes les plaques à tester (en supposant ~ 10 ml/96-Well plate). Immédiatement avant de Pipetter la culture bactérienne dans chaque puits, induire l’expression des reporters avec ATC ajouté à la culture en vrac. Incuber les puits en les secouant pendant la nuit. Pour mesurer les taux relatifs de mauvaise traduction, transférez les cultures à une plaque noire (pour augmenter la sensibilité de la détection de fluorescence), mesurez la fluorescence de GFP, et puis, faites tourner les plaques vers le bas pour pellets les bactéries. Transférer le surnageant sur une plaque blanche pour la mesure de l’activité Nluc. S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre. Figure 4 : Résultat représentatif de l’utilisation du reporter Renilla-Firefly mesurant le taux de mauvaise traduction en présence de kasugamycine dans différentes souches. Taux de mauvaise traduction de l’aspartate pour l’asparagine en (a) sauvage-type M. smegmatis et (B) une souche supprimée pour la Ksga (∆ Ksga) après traitement par la kasugamycine (KSG) mesurée par la Renilla-Firefly Dual reporter. Les cultures ont été traitées avec de la kasugamycine à des doses indiquées (en microgrammes/millilitre) pendant 6 h avant la lyse cellulaire et les mesures. Les ratios Ren/FF corrigés (axes y) sont indicatifs de l’aspartate pour les taux de mauvaise traduction de l’asparagine. La suppression de Ksga entraîne un taux de mauvaise traduction de base plus élevé, ce qui est plus résistant à la modulation par la kasugamycine. Les barres indiquent les valeurs moyennes, avec une déviation standard comme erreur. S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre. Figure 5 : Résultat représentatif de l’utilisation d’un reporter de Nluc-GFP mesurant le taux de mauvaise traduction en présence de kasugamycine. Taux de mauvaise traduction relatifs de l’aspartate pour l’asparagine dans les M. smegmatis de type sauvage mesurés par le reporter nluc/GFP, après traitement par kasugamycine (KSG) pendant la nuit (16 h). Les barres indiquent les valeurs moyennes, avec une déviation standard comme erreur. S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Discussion

Le protocole décrit ici peut être adapté pour la mesure des taux de mauvaise traduction dans une grande variété d’organismes. Il y a un certain nombre de considérations qui devraient être maintenues à l’esprit lors de l’adaptation du protocole à d’autres systèmes. Premièrement, la finalité de la mesure doit être envisagée. Pour la mesure exacte des taux de mauvaise traduction à l’aide de Reporters à gain de fonction, ce qui est nécessaire est (a) un dosage de lecture robuste (par exemple, la fonction enzymatique [dans ce cas, l’activité de la luciférase] avec une large plage linéaire). Aussi, recherchez (b) une perte de la mutation de fonction dans un résidu critique de la protéine reporter qui se traduit par une perte de fonction très importante, en deçà du taux attendu de mauvaise traduction. Par exemple, si le taux d’erreur de traduction attendu à mesurer est approximativement de 10 à3/codon, la perte de mutation de fonction doit être supérieure à 1 000. Sinon, la gamme inférieure d’événements de mauvaise traduction ne sera pas détectée de manière sensible. Enfin, pour la mesure exacte des taux de mauvaise traduction à l’aide de rapporteurs de gain de fonction, (c) un reporter de référence robuste est nécessaire — dans ce cas, luciférase Firefly pour la section 1 du protocole. Idéalement, le reporter de référence doit être fusionné avec le reporter enzymatique muté, garantissant (à toutes fins utiles) qu’ils sont tous deux exprimés en ratios équimolaires. La lecture de référence (et de reporter primaire) doit être robuste pour les perturbations dans les environnements exposés. Par exemple, la fluorescence du GFP de type sauvage est très sensible à la perturbation par des variations de pH28, ce qui le rend impropre comme point de référence pour la mesure des taux de mauvaise traduction dans les mycobactéries phagocysées dans les macrophages, qui résident dans phagosomes inférieurs à pH 729. D’autre part, pour des applications telles que le criblage de petites molécules, les considérations les plus importantes pour un écran primaire seront la reproductibilité des mesures (c.-à-d., la précision, par opposition à la précision), la minimisation de la manutention manuelle, et les petites volumes de culture. Les mesures exactes des taux de mauvaise traduction sont moins importantes et peuvent être effectuées en tant que tests secondaires. Enfin, il convient de noter que les reporters décrits dans ce protocole, sur la base de la fonction enzymatique des enzymes de la luciférase, ne mesureront que les taux de mauvaise traduction moyenne d’une population bactérienne, mais ne peuvent pas donner d’informations sur l’hétérogénéité à une seule cellule variation des taux de mauvaise traduction. Compte tenu de l’importance de la variabilité unicellulaire dans les phénotypes adaptatifs30,31,32, les reporters fluorescents pour la mesure des événements de mauvaise traduction ont été développés12,33 , y compris pour la mesure de la mauvaise traduction dans les mycobactéries5.

Après avoir examiné les exigences relatives à la mesure de la mauvaise traduction, il convient de noter que les reporters de gain de fonction génétiques tels que décrits dans ce protocole ne peuvent mesurer qu’un type de mauvaise traduction (c.-à-d. une substitution d’acides aminés pour une codon) par reporter. Par conséquent, pour la mesure de différents événements de mauvaise traduction, plusieurs reporters sont nécessaires. Par exemple, pour la mesure de la mauvaise traduction par des erreurs de décodage ribosomique de codons à quasi-cognées par lysyl-tRNA à une position, au moins 16 Reporters sont requis2,3,11. La spectrométrie de masse de haute précision et la bioinformatique permettent l’identification potentielle de nombreux types différents d’événements de mauvaise traduction simultanément18; Cependant, ces méthodes viennent également avec des mises en garde. En général, ils sont moins précis que les reporters à gain de fonction. En outre, comme indiqué précédemment, ils sont moins aptes à la détection de certains types de mauvaise traduction, à savoir ceux qui pourraient être conflés avec une déamidation non enzymatique23. Enfin, la spectrométrie de masse n’est pas appropriée en tant que lecture pour le dépistage à moyen ou à haut débit.

Pour l’adaptation de ces reporters et protocoles pour la mesure de la mauvaise traduction dans d’autres systèmes, d’autres considérations incluent une expression robuste du reporter dans le système de modèle désiré. Nous avons d’abord tenté d’utiliser le système dual-luciférase développé par Farabrire et ses collègues dans notre système mycobactérien sans modifications, mais n’a pas eu de succès, en raison d’un manque d’expression de reporter. Un dépannage approfondi a permis de déterminer que l’optimisation des codons et une modification mineure des séquences des reporters étaient nécessaires pour permettre une expression robuste25 (voir ci-dessus). Il est concevable que des adaptations analogues des journalistes soient nécessaires pour être utilisées dans d’autres systèmes.

Enfin, il convient de tenir compte du type d’événement de mauvaise traduction mesuré. Par exemple, s’il y a un besoin de mesurer l’arrêt-codon readthrough (suppression de non-sens), la perte de la mutation de fonction de codon d’arrêt doit être introduite dans une région non critique de la protéine primaire de reporter34. Dans le cas contraire, seuls les événements spécifiques de suppression de non-sens qui récupèrent le résidu critique (et, par conséquent, la fonction de reporter) seront mesurés par le dosage, ce qui pourrait entraîner une sous-estimation substantielle des taux de fausse traduction réels. Il y a de plus en plus de preuves que l’erreur translationnelle joue un rôle adaptatif possible dans un grand nombre d’organismes1,12,13,35. Toutefois, la mesure des événements de mauvaise traduction est encore limitée à un nombre restreint, quoique croissant, d’espèces modèles. L’adaptation de méthodes sensibles pour mesurer la mauvaise traduction a le potentiel d’accroître encore la compréhension des scientifiques du rôle de l’erreur de traduction dans la physiologie et la pathologie.

Offenlegungen

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Ce travail était en partie appuyé par des subventions de la Fondation Bill et Melinda Gates (OPP1109789), de la Fondation nationale des sciences naturelles de la Chine (31570129), et des fonds de démarrage de l’école de médecine de l’Université de Tsinghua à BJ bj est un Wellcome Trust Chercheur (207487/Z/17/Z).

Materials

Middlebrook 7H9 BD Difco 271310
anhydrotetracycline Cayman Chemical  10009542
kasugamycin sigma K4013
Dual-luciferase reporter assay system promega E1960
Nano-Glo luciferase assay promega N1120
Fluoroskan Ascent FL luminometer Thermo /
Assay Plate, 96 Well White, Flat Bottom High Binding, No Lid Costar 3922
Assay Plate, 96 Well Black, Flat Bottom High Biding, No Lid Costar 3925
96 Well Cell Culture Cluster, Flat Bottom with Lid Costar 3599
Non-commercial reagents (plasmids)
pUV-TetOR-RenFF NA NA episomal shuttle plasmid that allows tetracycline-inducible expression of the wild-type dual luciferase reporter
pUV-TetOR-Ren-D120N-FF dual-luciferase reporter with mutated Renilla
pUV-TetOR-Ag85ASec-Nluc-D140N NA NA episomal shuttle plasmid with a tetracyclin-inducible secretable version of mutated Nluc luciferase
pMC1S-GFP NA NA Mycobacterial integrated (L5 site) vector for tetracycline-inducible expression of GFP
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Referenzen

  1. Ribas de Pouplana, L., Santos, M. A., Zhu, J. H., Farabaugh, P. J., Javid, B. Protein mistranslation: friend or foe. Trends in Biochemical Sciences. 39 (8), 355-362 (2014).
  2. Leng, T., Pan, M., Xu, X., Javid, B. Translational misreading in Mycobacterium smegmatis increases in stationary phase. Tuberculosis (Edinburgh). 95 (6), 678-681 (2015).
  3. Manickam, N., Nag, N., Abbasi, A., Patel, K., Farabaugh, P. J. Studies of translational misreading in vivo show that the ribosome very efficiently discriminates against most potential errors. RNA. 20 (1), 9-15 (2014).
  4. Netzer, N., et al. Innate immune and chemically triggered oxidative stress modifies translational fidelity. Nature. 462 (7272), 522-526 (2009).
  5. Su, H. W., et al. The essential mycobacterial amidotransferase GatCAB is a modulator of specific translational fidelity. Nature Microbiology. 1 (11), 16147 (2016).
  6. Li, L., et al. Naturally occurring aminoacyl-tRNA synthetases editing-domain mutations that cause mistranslation in Mycoplasma parasites. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (23), 9378-9383 (2011).
  7. Li, L., et al. Leucyl-tRNA synthetase editing domain functions as a molecular rheostat to control codon ambiguity in Mycoplasma pathogens. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (10), 3817-3822 (2013).
  8. Ling, J., Soll, D. Severe oxidative stress induces protein mistranslation through impairment of an aminoacyl-tRNA synthetase editing site. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (9), 4028-4033 (2010).
  9. Raina, M., et al. Reduced amino acid specificity of mammalian tyrosyl-tRNA synthetase is associated with elevated mistranslation of Tyr codons. Journal of Biological Chemistry. , (2014).
  10. Wu, J., Fan, Y., Ling, J. Mechanism of oxidant-induced mistranslation by threonyl-tRNA synthetase. Nucleic Acids Research. 42 (10), 6523-6531 (2014).
  11. Kramer, E. B., Farabaugh, P. J. The frequency of translational misreading errors in E. coli is largely determined by tRNA competition. RNA. 13 (1), 87-96 (2007).
  12. Evans, C. R., Fan, Y., Weiss, K., Ling, J. Errors during Gene Expression: Single-Cell Heterogeneity, Stress Resistance, and Microbe-Host Interactions. mBio. 9 (4), (2018).
  13. Mohler, K., Ibba, M. Translational fidelity and mistranslation in the cellular response to stress. Nature Microbiology. 2, 17117 (2017).
  14. Bullwinkle, T. J., et al. Oxidation of cellular amino acid pools leads to cytotoxic mistranslation of the genetic code. Elife. 3, (2014).
  15. Fan, Y., et al. Heterogeneity of Stop Codon Readthrough in Single Bacterial Cells and Implications for Population Fitness. Molecular Cell. 67 (5), 826-836 (2017).
  16. Fan, Y., et al. Protein mistranslation protects bacteria against oxidative stress. Nucleic Acids Research. 43 (3), 1740-1748 (2015).
  17. Schwartz, M. H., Pan, T. Temperature dependent mistranslation in a hyperthermophile adapts proteins to lower temperatures. Nucleic Acids Research. 44 (1), 294-303 (2016).
  18. Schwartz, M. H., Waldbauer, J. R., Zhang, L., Pan, T. Global tRNA misacylation induced by anaerobiosis and antibiotic exposure broadly increases stress resistance in Escherichia coli. Nucleic Acids Research. , (2016).
  19. Curnow, A. W., et al. Glu-tRNAGln amidotransferase: a novel heterotrimeric enzyme required for correct decoding of glutamine codons during translation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 94 (22), 11819-11826 (1997).
  20. Rathnayake, U. M., Wood, W. N., Hendrickson, T. L. Indirect tRNA aminoacylation during accurate translation and phenotypic mistranslation. Current Opinion in Chemical Biology. 41, 114-122 (2017).
  21. Chaudhuri, S., et al. Kasugamycin potentiates rifampicin and limits emergence of resistance in Mycobacterium tuberculosis by specifically decreasing mycobacterial mistranslation. eLife. 7, (2018).
  22. Toosky, M., Javid, B. Novel diagnostics and therapeutics for drug-resistant tuberculosis. British Medical Bulletin. 110 (1), 129-140 (2014).
  23. Robinson, N. E., Robinson, A. B. Deamidation of human proteins. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 98 (22), 12409-12413 (2001).
  24. Miura, S., et al. Urate oxidase is imported into peroxisomes recognizing the C-terminal SKL motif of proteins. European Journal of Biochemistry. 223 (1), 141-146 (1994).
  25. Javid, B., et al. Mycobacterial mistranslation is necessary and sufficient for rifampicin phenotypic resistance. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (3), 1132-1137 (2014).
  26. Wong, S. Y., et al. Functional role of methylation of G518 of the 16S rRNA 530 loop by GidB in Mycobacterium tuberculosis. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 57 (12), 6311-6318 (2013).
  27. Wiker, H. G., Harboe, M. The antigen 85 complex: a major secretion product of Mycobacterium tuberculosis. Microbiological Reviews. 56 (4), 648-661 (1992).
  28. Roberts, T. M., et al. Identification and Characterisation of a pH-stable GFP. Scientific Reports. 6, 28166 (2016).
  29. Li, H., Wu, M., Shi, Y., Javid, B. Over-Expression of the Mycobacterial Trehalose-Phosphate Phosphatase OtsB2 Results in a Defect in Macrophage Phagocytosis Associated with Increased Mycobacterial-Macrophage Adhesion. Frontiers in Microbiology. 7, 1754 (2016).
  30. Aldridge, B. B., et al. Asymmetry and aging of mycobacterial cells lead to variable growth and antibiotic susceptibility. Science. 335 (6064), 100-104 (2012).
  31. Rego, E. H., Audette, R. E., Rubin, E. J. Deletion of a mycobacterial divisome factor collapses single-cell phenotypic heterogeneity. Nature. 546 (7656), 153-157 (2017).
  32. Zhu, J. H., et al. Rifampicin can induce antibiotic tolerance in mycobacteria via paradoxical changes in rpoB transcription. Nature Communications. 9 (1), 4218 (2018).
  33. Lant, J. T., et al. Visualizing tRNA-dependent mistranslation in human cells. RNA Biology. 15 (4-5), 567-575 (2018).
  34. Grentzmann, G., Ingram, J. A., Kelly, P. J., Gesteland, R. F., Atkins, J. F. A dual-luciferase reporter system for studying recoding signals. RNA. 4 (4), 479-486 (1998).
  35. Melnikov, S. V., van den Elzen, A., Stevens, D. L., Thoreen, C. C., Soll, D. Loss of protein synthesis quality control in host-restricted organisms. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. , (2018).

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Chen, Y., Pan, M., Chen, Y., Javid, B. Measurement of Specific Mycobacterial Mistranslation Rates with Gain-of-function Reporter Systems. J. Vis. Exp. (146), e59453, doi:10.3791/59453 (2019).
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