Verbesserung der Transplantation von humaninduzierten pluripotenten Stammzellen abgeleiteten Kardiomyozyten über eine transiente Hemmung der Rho Kinase Aktivität
Summary
In diesem Protokoll zeigen wir und erläutern, wie man humaninduzierte pluripotente Stammzellen zur Kardiomyozytendifferenzierung und -reinigung verwendet und weiter, wie die Transplantationseffizienz mit dem Rho-assoziierten Proteinkinase-Inhibitor verbessert werden kann. Vorbehandlung in einem Maus-Myokardinfarktmodell.
Abstract
Ein entscheidender Faktor bei der Verbesserung der Wirksamkeit der Zelltherapie bei der Myokardregeneration ist die sichere und effiziente Erhöhung der Zellentransplantationsrate. Y-27632 ist ein hochwirksamer Inhibitor der Rho-assoziierten, coiled-coil-haltigen Proteinkinase (RhoA/ROCK) und wird verwendet, um Dissoziations-induzierte Zellapoptose (Anoikis) zu verhindern. Wir zeigen, dass die Y-27632-Vorbehandlung für humaninduzierte pluripotente Stammzell-abgeleitete Kardiomyozyten (hiPSC-CMs+RI) vor der Implantation zu einer Verbesserung der Zellengraftmentrate in einem Mausmodell des akuten Myokardinfarkts (MI) führt. Hier beschreiben wir ein komplettes Verfahren der HiPSC-CMs-Differenzierung, -Reinigung und -Zellvorbehandlung mit Y-27632 sowie die daraus resultierende Zellkontraktion, Kalziumtransientenmessungen und Transplantation in Maus-MI-Modelle. Die vorgeschlagene Methode bietet eine einfache, sichere, effektive und kostengünstige Methode, die die Zellentransplantationsrate deutlich erhöht. Diese Methode kann nicht nur in Verbindung mit anderen Methoden zur weiteren Verbesserung der Zelltransplantationseffizienz eingesetzt werden, sondern bietet auch eine günstige Grundlage für die Untersuchung der Mechanismen anderer Herzerkrankungen.
Introduction
Stammzellbasierte Therapien haben ein erhebliches Potenzial als Behandlung von Herzschäden durch MI1gezeigt. Die Verwendung differenzierter HiPSCs bietet eine unerschöpfliche Quelle für hiPSC-CMs2 und öffnet die Tür für die schnelle Entwicklung bahnbrechender Behandlungen. Es gibt jedoch noch viele Einschränkungen bei der therapeutischen Übersetzung, einschließlich der Herausforderung der stark niedrigen Transplantationsrate implantierter Zellen.
Dissoziierende Zellen mit Trypsin löst Anoikis3, die erst beschleunigt wird, wenn diese Zellen in raue Umgebungen wie das ischämische Myokard injiziert werden, wo die hypoxische Umgebung den Kurs in Richtung Zelltod beschleunigt. Von den verbleibenden Zellen wird ein großer Teil von der Implantationsstelle in den Blutkreislauf ausgewaschen und in der Peripherie verteilt. Einer der wichtigsten apoptotischen Pfade ist der RhoA/ROCK-Weg4. Basierend auf früheren Forschungen reguliert der RhoA/ROCK-Signalweg die aktin zytoskelettale Organisation5,6, die für Zellfunktionsstörungen verantwortlich ist7,8. Der ROCK-Hemmer Y-27632 wird häufig bei der somatischen und Stammzelldissoziation und Passaging verwendet, um die Zelladhäsion zu erhöhen und die Zellapoptose9,10,11zu reduzieren. In dieser Studie wird Y-27632 zur Behandlung von HiPSC-CMs vor der Transplantation verwendet, um die Zellengraftmentrate zu erhöhen.
Es wurden mehrere Methoden zur Verbesserung der Zellentransplantationsrate etabliert, wie Hitzeschock und Kellermembranmatrixbeschichtung12. Abgesehen von diesen Methoden kann die Gentechnologie auch die Proliferation von Kardiomyozyten13 oder die Umkehrung nichtmyokardischer Zellen in Kardiomyozyten14fördern. Aus bioengineering-Sicht werden Kardiomyozyten auf ein Biomaterialgerüst gesetzt, um die Transplantationseffizienz zu verbessern15. Leider sind die meisten dieser Methoden kompliziert und kostspielig. Im Gegenteil, die hier vorgeschlagene Methode ist einfach, kosteneffizient und effektiv, und sie kann als Basalbehandlung vor der Transplantation sowie in der Konjugation mit anderen Technologien eingesetzt werden.
Protocol
Representative Results
Discussion
Zu den wichtigsten Schritten dieser Studie gehören die Erlangung reiner HiPSC-CMs, die Verbesserung der Aktivität von HiPSC-CMs durch Y-27632-Vorbehandlung und schließlich die Transplantation einer genauen Menge an HiPSC-CMs in ein Maus-MI-Modell.
Die wichtigsten Themen, die hier angesprochen wurden, waren, dass wir zunächst die glukosefreien Reinigungsmethoden19 optimiert und ein neuartiges effizientes Reinigungssystem etabliert haben. Das Systemverfahren umfasste …
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Die Autoren danken Dr. Joseph C. Wu (Stanford University) für die freundliche Bereitstellung des Fluc-GFP-Konstrukts und Dr. Yanwen Liu für die hervorragende technische Unterstützung. Diese Studie wird von den National Institutes of Health RO1 Grants HL95077, HL114120, HL131017, HL138023, UO1 HL134764 (zu J.Z.) und HL121206A1 (zu L.Z.) und einem R56-Stipendium HL142627 (zu W.Z.) unterstützt, einem American Heart Scientist 16SDG30410018 und die University of Alabama at Birmingham Faculty Development Grant (zu W.Z.).
Materials
| Reagent | |||
| Accutase (stem cell detachment solution) | STEMCELL Technologies | #07920 | |
| B27 minus insulin | Fisher Scientific | A1895601 | |
| B27 Supplement | Fisher Scientific | 17-504-044 | |
| CHIR99021 | Stem Cell Technologies | 72054 | |
| DMEM (1x), high glucose, HEPES, no phenol red | Thermofisher | 20163029 | |
| Fetal bovine serum | Atlanta Biologicals | S11150 | |
| Fluo-4 AM (calcium indicator) | Invitrogen/Thermofisher | F14201 | |
| Glucose-free RPMI 1640 | Fisher Scientific | 11879020 | |
| IWR1 | Stem Cell Technologies | 72562 | |
| Matrigel (extracellular matrix ) | Fisher Scientific | CB-40230C | |
| mTeSR (human pluripotent stem cells medium) | STEMCELL Technologies | 85850 | |
| Pen-strep antibiotic | Fisher Scientific | 15-140-122 | |
| Pluronic F-127 (surfactant polyol) | Sigma-Aldrich | P2443 | |
| Rho activator II | Cytoskeleton | CN03 | |
| RPMI1640 | Fisher Scientific | 11875119 | |
| Sodium DL-lactate | Sigma-Aldrich | L4263 | |
| TrypLE (cell-dissociation enzymes) | Fisher Scientific | 12-605-010 | |
| Verapamil | Sigma-Aldrich | V4629 | |
| Y-27632 | STEMCELL Technologies | 72304 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment and Supplies | |||
| IVIS Lumina III Bioluminescence Instruments | PerkinElmer | CLS136334 | |
| 15 mm Coverslips | Warner | CS-15R15 | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5415R | |
| Confocal Microscope | Olympus | IX81 | |
| Cryostat | Thermo Scientific | NX50 | |
| Dual Automatic Temperature Controller | Warner Instruments | TC-344B | |
| Electrophoresis Power Supply | BIO-RAD | 1645050 | |
| Fluoresence Microscope | Olympus | IX83 | |
| High Speed Camera | pco | 1200 s | |
| Laser Scan Head | Olympus | FV-1000 | |
| Low Profile Open Bath Chamber (mounts into above microincubation system) | Warner Instruments | RC-42LP | |
| Microincubation System | Warner Instruments | DH-40iL | |
| Minivent Mouse Ventilator | Harvard Apparatus | 845 | |
| NOD/SCID mice | Jackson Laboratory | 001303 | |
| Precast Protein Gels | BIO-RAD | 4561033 | |
| PVDF Transfer Packs | BIO-RAD | 1704156 | |
| Trans-Blot System | BIO-RAD | Trans-Blot Turbo | |
| Hot bead sterilizer | Fine Science Tools | 18000-45 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Antibody | |||
| Anti-human Nucleolin (Alexa Fluor 647) | Abcam | ab198580 | |
| Cardiac Troponin T | R&D Systems | MAB1874 | |
| Cardiac Troponin C | Abcam | ab137130 | |
| Cardiac Troponin I | Abcam | ab47003 | |
| Cy5-donkey anti-mouse | Jackson ImmunoResearch Laboratory | 715-175-150 | |
| Cy3-donkey anti-rabbit | Jackson ImmunoResearch Laboratory | 711-165-152 | |
| Fitc-donkey anti-mouse | Jackson ImmunoResearch Laboratory | 715-095-150 | |
| GAPDH | Abcam | ab22555 | |
| Human Cardiac Troponin T | Abcam | ab91605 | |
| Integrin β1 | Abcam | ab24693 | |
| Ki67 | EMD Millipore | ab9260 | |
| N-cadherin | Abcam | ab18203 | |
| Phospho-Myosin Light Chain 2 | Cell Signaling Technology | 3671s | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Software | |||
| Matlab | MathWorks | R2016A | |
| Image J | NIH | 1.52g |
Referenzen
- Menasche, P., et al. Towards a clinical use of human embryonic stem cell-derived cardiac progenitors: a translational experience. European Heart Journal. 36 (12), 743-750 (2015).
- Burridge, P. W., Keller, G., Gold, J. D., Wu, J. C. Production of de novo cardiomyocytes: human pluripotent stem cell differentiation and direct reprogramming. Cell Stem Cell. 10 (1), 16-28 (2012).
- Frisch, S. M., Francis, H. Disruption of epithelial cell-matrix interactions induces apoptosis. Journal of Cell Biology. 124 (4), 619-626 (1994).
- Haun, F., et al. Identification of a novel anoikis signalling pathway using the fungal virulence factor gliotoxin. Nature Communications. 9 (1), 3524 (2018).
- Ohashi, K., et al. Rho-associated kinase ROCK activates LIM-kinase 1 by phosphorylation at threonine 508 within the activation loop. Journal of Biological Chemistry. 275 (5), 3577-3582 (2000).
- Katoh, K., Kano, Y., Noda, Y. Rho-associated kinase-dependent contraction of stress fibres and the organization of focal adhesions. Journal of The Royal Society Interface. 8 (56), 305-311 (2011).
- Paoli, P., Giannoni, E., Chiarugi, P. Anoikis molecular pathways and its role in cancer progression. Biochimica et Biophysica Acta. 1833 (12), 3481-3498 (2013).
- Legate, K. R., Fassler, R. Mechanisms that regulate adaptor binding to beta-integrin cytoplasmic tails. Journal of Cell Science. 122 (Pt 2), 187-198 (2009).
- Watanabe, K., et al. A ROCK inhibitor permits survival of dissociated human embryonic stem cells. Nature Biotechnology. 25 (6), 681-686 (2007).
- Emre, N., et al. The ROCK inhibitor Y-27632 improves recovery of human embryonic stem cells after fluorescence-activated cell sorting with multiple cell surface markers. PLoS One. 5 (8), e12148 (2010).
- Ni, Y., Qin, Y., Fang, Z., Zhang, Z. ROCK Inhibitor Y-27632 Promotes Human Retinal Pigment Epithelium Survival by Altering Cellular Biomechanical Properties. Current Molecular Medicine. 17 (9), 637-646 (2017).
- Laflamme, M. A., et al. Cardiomyocytes derived from human embryonic stem cells in pro-survival factors enhance function of infarcted rat hearts. Nature Biotechnology. 25 (9), 1015-1024 (2007).
- Zhu, W., Zhao, M., Mattapally, S., Chen, S., Zhang, J. CCND2 Overexpression Enhances the Regenerative Potency of Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiomyocytes: Remuscularization of Injured Ventricle. Circulation Research. 122 (1), 88-96 (2018).
- Song, K., et al. Heart repair by reprogramming non-myocytes with cardiac transcription factors. Nature. 485 (7400), 599-604 (2012).
- Ye, L., et al. Cardiac repair in a porcine model of acute myocardial infarction with human induced pluripotent stem cell-derived cardiovascular cells. Cell Stem Cell. 15 (6), 750-761 (2014).
- Tohyama, S., et al. Glutamine Oxidation Is Indispensable for Survival of Human Pluripotent Stem Cells. Cell Metabolism. 23 (4), 663-674 (2016).
- Ong, S. G., et al. Microfluidic Single-Cell Analysis of Transplanted Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiomyocytes After Acute Myocardial Infarction. Circulation. 132 (8), 762-771 (2015).
- Zhao, M., et al. Y-27632 Preconditioning Enhances Transplantation of Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiomyocytes in Myocardial Infarction Mice. Cardiovascular Research. , (2018).
- Tohyama, S., et al. Distinct metabolic flow enables large-scale purification of mouse and human pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes. Cell Stem Cell. 12 (1), 127-137 (2013).
- Silginer, M., Weller, M., Ziegler, U., Roth, P. Integrin inhibition promotes atypical anoikis in glioma cells. Cell Death & Disease. 5, e1012 (2014).
- Lelievre, E. C., et al. N-cadherin mediates neuronal cell survival through Bim down-regulation. PLoS One. 7 (3), e33206 (2012).
- Murata, K., et al. Increase in cell motility by carbon ion irradiation via the Rho signaling pathway and its inhibition by the ROCK inhibitor Y-27632 in lung adenocarcinoma A549 cells. Journal of Radiation Research. 55 (4), 658-664 (2014).
- Srivastava, K., Shao, B., Bayraktutan, U. PKC-beta exacerbates in vitro brain barrier damage in hyperglycemic settings via regulation of RhoA/Rho-kinase/MLC2 pathway. Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism. 33 (12), 1928-1936 (2013).
