落射蛍光マウント全体を用いたマウス胚発生中に心臓商工会議所発展の分析
Summary
心室固有 MLC 2 v tdTomato レポーター ノックアウトのマウスから解剖マウス胚全体のマウント epifluorescent 顕微鏡を用いたマウス心臓の開発を検討するプロトコルを提案します。このメソッドでは、心室形成労働集約的な組織化学的方法なしマウス心臓の発達過程の各段階を直接可視化することが出来ます。
Abstract
このプロトコルの目的は、マウス胚の郭清とマウス萌芽期の心室の部屋心室固有蛍光レポーター ノックイン マウス (MLC 2 v tdTomato マウス) を使用して心臓の発達過程の可視化方法の説明です。リニア心臓管形成、ループ、心臓の管および 4 室中隔、心臓の開発が含まれます。これらの複雑なプロセスはすべての脊椎動物で非常に節約されます。マウス胚の心臓は、心の発達研究のため広く使用されています。ただし、彼らの非常に小さなサイズのためマウス胚心を解剖するは、技術的に挑戦的なです。さらに、しばしば心臓室形成の可視化には、in situ ハイブリダイゼーション、β-ガラクトシダーゼ LacZ レポーター マウス、または断面胚心の免疫染色を使用して染色が必要があります。ここでは、マウスの胚中心を細かく分析し、全体のマウント epifluorescent 顕微鏡を用いた MLC 2 v tdTomato マウス心室形成を直接可視化する方法をについて説明します。この方法では、心臓管形成とループ、およびマウス胚のさらなる実験的操作なしの 4 つの商工会議所形成を直接調査することが可能です。MLC 2 v tdTomato 記者ノックイン マウス ラインは、例としてこのプロトコルで使用されますが、このプロトコルは、他の心臓特異蛍光レポーター トランスジェニック マウスのラインに適用できます。
Introduction
心臓の発達過程室形成は、複数胚の形態的に異なる段階1,2と移り変わり複雑なプロセスです。心臓前駆細胞の三日月形リニア心臓の管を形作るし、伸長と成長の中心のスパイラル形状を形成するループを経る。その隔プロセスの後、心臓の開発は 4 chambered 中心に変換されます。これらのプロセスのいずれかの中断は、発達心臓の欠陥で結果します。したがって、心臓の発達過程室形成の分子機構を理解することが重要です。心臓の開発で多数の先行研究、にもかかわらずこの複雑なプロセスの私達の理解は限られています。
In situ ハイブリダイゼーション、免疫組織化学、および β-ガラクトシダーゼは、LacZ レポーター マウスを用いた染色を広く心臓特定または商工会議所特定構造遺伝子の分類によってマウス心臓開発中に商工会議所の形成を研究に使用されているまたはタンパク質 (例えば、Nppa クーデター TFII Irx4、MLC 2 a、MLC 2 v)3,4,5,6,7,8,9,10。ただし、これらの実験は、マウスの胚を使用して膨大な時間と専門知識、ので必要する必要がありますいくつかの異なる実験手順11を順番に実行します。ここでは、MLC 2 v tdTomato 記者ノックイン マウス12から解剖した胚を使用して発展途上心室を視覚化する単純な全体マウント epifluorescent 顕微鏡法について述べる。以前使用していた方法と比較してこの方法の利点は、実験的バリエーションを作成可能性があります多くの場合複雑な実験手順を避けるためです。このプロトコルの主な目的は、マウス胚および開発の心を解剖し退屈な組織化学的実験なしマウス心臓チャンバーの開発の各段階を確認する方法を説明します。早期の心臓マーカーをラベリング様々 な他トランスジェニック マウス ラインを使用して心臓の開発を評価するためにこのメソッドを簡単に適用できる (例えば、Mesp1Cre: Rosa26EYFP13, Isl1Cre: Rosa26EYFP13Hcn4H2BGFP14Hcn4Cre: ローザ mT/mG14, Nkx2 5Cre: ローザ mT/mG14、Hcn4 eGFP15Isl1Cre: ローザ mT/mG14Nkx2.5Cre: Rosa26tdTomato15、および16の TgMef2c AHF GFP マウス)。
Protocol
Representative Results
Discussion
ここで説明する方法は心室または心臓固有の構造遺伝子または蛋白質のラベルに手間のかかる実験を行わず心室の開発を検討する比較的簡単です。したがって、このメソッドは、immunostained 中心部のセクションで発見された多くの場合技術的な変動を最小限に抑えます。
マウスの萌芽期の年齢・胚の心の解剖の正確な推定を含むこのメソッドを正常に実行するための 2 つ…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この作品は、NIH R03 HL140264 によって支えられた (雄 j.N) とギリアド ・ サイエンシズ研究学者プログラム (雄 j.N)。
Materials
| dissecting microscope | Leica | MZ125 | |
| DNA ladder (100 bp) | Promega | G2101 | |
| epifluorescence dissecting microscope | Leica | M165 FC | |
| GoTaq Green master Mix | Promega | M712 | |
| PCR machine (master cycler) | Eppendorf | 6336000023 |
Referenzen
- Evans, S. M., Yelon, D., Conlon, F. L., Kirby, M. L. Myocardial lineage development. Circulation Research. 107 (12), 1428-1444 (2010).
- Paige, S. L., Plonowska, K., Xu, A., Wu, S. M. Molecular regulation of cardiomyocyte differentiation. Circulation Research. 116 (2), 341-353 (2015).
- Lee, K. J., et al. Myosin light chain-2 luciferase transgenic mice reveal distinct regulatory programs for cardiac and skeletal muscle-specific expression of a single contractile protein gene. Journal of Biological Chemistry. 267 (22), 15875-15885 (1992).
- Chen, J., et al. Selective requirement of myosin light chain 2v in embryonic heart function. Journal of Biological Chemistry. 273 (2), 1252-1256 (1998).
- Ross, R. S., Navankasattusas, S., Harvey, R. P., Chien, K. R. An HF-1a/HF-1b/MEF-2 combinatorial element confers cardiac ventricular specificity and established an anterior-posterior gradient of expression. Development. 122 (6), 1799-1809 (1996).
- Christoffels, V. M., et al. Chamber formation and morphogenesis in the developing mammalian heart. Dev Biol. 223 (2), 266-278 (2000).
- Wu, S. P., et al. Atrial identity is determined by a COUP-TFII regulatory network. Developmental Cell. 25 (4), 417-426 (2013).
- Nelson, D. O., Jin, D. X., Downs, K. M., Kamp, T. J., Lyons, G. E. Irx4 identifies a chamber-specific cell population that contributes to ventricular myocardium development. Developmental Dynamics. 243 (3), 381-392 (2014).
- Bao, Z. Z., Bruneau, B. G., Seidman, J. G., Seidman, C. E., Cepko, C. L. Regulation of chamber-specific gene expression in the developing heart by Irx4. Science. 283 (5405), 1161-1164 (1999).
- Kubalak, S. W., Miller-Hance, W. C., O’Brien, T. X., Dyson, E., Chien, K. R. Chamber specification of atrial myosin light chain-2 expression precedes septation during murine cardiogenesis. Journal of Biological Chemistry. 269 (24), 16961-16970 (1994).
- Bardot, P., et al. The TAF10-containing TFIID and SAGA transcriptional complexes are dispensable for early somitogenesis in the mouse embryo. Development. 144 (20), 3808-3818 (2017).
- Zhang, Z., Nam, Y. J. Generation of MLC-2v-tdTomato knock-in reporter mouse line. Genesis. , (2018).
- Ieda, M., et al. Direct reprogramming of fibroblasts into functional cardiomyocytes by defined factors. Cell. 142 (3), 375-386 (2010).
- Liang, X., et al. HCN4 dynamically marks the first heart field and conduction system precursors. Circulation Research. 113 (4), 399-407 (2013).
- Nam, Y. J., et al. Induction of diverse cardiac cell types by reprogramming fibroblasts with cardiac transcription factors. Development. 141 (22), 4267-4278 (2014).
- Spater, D., et al. A HCN4+ cardiomyogenic progenitor derived from the first heart field and human pluripotent stem cells. Nature Cell Biology. 15 (9), 1098-1106 (2013).
- O’Brien, T. X., Lee, K. J., Chien, K. R. Positional specification of ventricular myosin light chain 2 expression in the primitive murine heart tube. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 90 (11), 5157-5161 (1993).
