Perfusione ex vivo della placenta del roditore

Tutte le procedure sperimentali sono state approvate dal Comitato istituzionale per la cura e l’uso degli animali della Rutgers University. 1. preparazione prima dell’esperimento Nota: questi passaggi possono essere eseguiti entro giorni/settimane prima dell’esperimento. Modificare la camera del recipiente.Nota: la Figura 1a, B Mostra la camera singola di vaso modificata. Spostare il sensore del termior da sotto la clip e piegarlo in modo che si blocchi liberamente nel bagno di perfusione (Figura 1B). Installare due aghi in acciaio inossidabile con punta smussata da 4 pollici con mozzi di collegamento Luer standard, 1 25 G e 1 23 G fissati sotto la clip termiagrumi e aggiungere un rubinetto a 3 vie per consentire la cannulazione della vascolarizzazione ombelicale (Figura 1B).Nota: i collegamenti Luer di diverse dimensioni del calibro sono codificati a colori. Ciò facilita l’identificazione dei vasi durante e dopo l’esperimento. Installare due Micropipette in vetro da 70 − 100 μm. Per ulteriori informazioni su queste procedure, si prega di rivedere i seguenti riferimenti10,11.Nota: il diametro della punta comunemente usato in questi esperimenti è compreso tra 70 e 100 μm. i diametri delle punte più grandi di questa gamma possono aggiungere difficoltà al processo di cannulazione, mentre i diametri delle punte inferiori a 60 μm possono perforare la parete vascolare durante la cannulazione. Preparare i legami dalla sutura di nylon sterile (per le estremità prossimali e distali dell’arteria uterina) e dalla sutura non sterile di seta intrecciata nera (per i vasi ombelicali). Fare legami singoli per sutura looping come per avviare un nodo quadrato o legare una scarpa, come descritto in precedenza11.Nota: i legami singoli sono comunemente fatti e conservati in una piastra di Petri riempita con un piccolo strato di gomma siliconica per aiutare a lavorare su uno sfondo appiccicoso. Preparare 2 L di soluzione fisiologica salina (PSS) contenente, in mmol/L, 129,8 NaCl, 5,4 KCl, 0,5 NaH2po4, 0,83 MgSO4, 19 NaHCO3, 1,8 CAcl2e 5,5 glucosio. Regolare il pH a 7,40 ± 0,02 aggiungendo lentamente alcune gocce di acido (1 M di acido cloridrico) o di base (1 N di idrossido di sodio) alla soluzione e attendere almeno 20 s prima di leggere la misura di pH regolata. Conservare PSS fino a quando non è pronto per l’uso in frigorifero per ridurre la contaminazione, ma non conservare per più di 2 settimane. Etichettare provette per microcentrifuga per la raccolta di effluenti “materni” e “fetali” ad ogni punto temporale, cioè “MBaseline, M10, M20,…” fino al 180 min timepoint. Preparare lo stesso per gli effluenti fetali (FBaseline, M10, M20,….). Calibrare tutte le apparecchiature utilizzate all’interno del sistema, tra cui la temperatura del bagno circolante e i monitor della pressione sanguigna associati al mantenimento di pressioni perfusato uterina (80 mmHg) e ombelicali (50 mmHg). Preparare una camera di dissezione (4 “diametro x 1” profondo) o un piatto riscaldante circolante riempiendo uno strato (< 0,25 ") di gomma siliconica. Questa modifica deve essere fatta in anticipo e come ci vorrà 12 − 24 h per la gomma ad asciugare.Nota: l’uso di un riscaldatore di ricircolo/piatto di refrigerazione è consigliato per i chirurghi principianti, in quanto il piatto non si muoverà e il tessuto manterrà una temperatura costante. 2. preparazione della stazione chirurgica e equilibratura delle attrezzature Accendere tutte le apparecchiature che supportano il sistema di perfusione per verificare la corretta funzione. Rimuovere il PSS dalla refrigerazione e dalla temperatura ambiente. Il PSS sarà utilizzato sia come perfusato che come superfusate. Posizionare una piccola pietra di gorgogliatura per consegnare una miscela di gas nel serbatoio superfusate. Le miscele comunemente utilizzate includono il 21% O2, 8% o 2, 3% o2e 0% o2. Accendere il gas per fornire piccole bolle alla soluzione superfusate. Regolare la consegna del gas per evitare spruzzi. Disporre la stazione di dissezione animale controllando anestetico, organizzando attrezzature chirurgiche e preparando legami di sutura. Preparare la camera di sezionamento raccogliendo i perni dissezione, accendendo il refrigeratore (o recuperando il ghiaccio) e riempiendo la camera dissezione (rivestita con silicone di gomma) con PSS freddo. Riempire delicatamente tutte le camere, gli aghi, le micropipette di vetro, i tubi e i serbatoi con PSS riscaldato, osservando attentamente ed eliminando le bolle d’aria, aspirandoli con una pipetta di trasferimento a punta fine. Girare tutti i rubinetti a 3 vie con “off” rivolto verso la direzione della pipetta per fissare il fluido all’interno della pipetta. Collocare una singola cravatta su ognuna delle due Micropipette di vetro preparate per la cannulazione uterina e sui due aghi a punta smussata designati per la cannulazione ombelicale. Fissare i legami con le pipette e gli aghi a punta smussata per evitare perdite durante i movimenti della camera (Figura 1C). 3. raccolta placentare Anestetizzare un ratto femmina incinta il giorno gestazionale 20 con 5% isoflurano per circa 4 min o fino a quando l’animale esibisce respiro affannosi. Spostare l’animale al cono del naso e somministrare il 2,5% − 3% di isoflurano per mantenere l’anestesia. Confermare la perdita di coscienza con una mancanza di punta pizzico riflesso.Nota: l’uso di un ratto al giorno gestazionale 20 è presentato in questo protocollo. Tuttavia, il protocollo rimane lo stesso se le condizioni sperimentali richiedono che la valutazione placentare avvenga prima della gestazione. Identificare e isolare il corno uterino (destra o sinistra) di scelta sollevando e diffondendo fuori lungo-vie al di fuori della carcassa del ratto. Utilizzando una sutura di seta intrecciata, legare l’arteria uterina all’estremità ovarica e alla fine vaginale del corno. Includere l’ovaio all’interno della sutura con il corno uterino. Usando le forbici chirurgiche, le accise via il corno uterino facendo tagli sul lato prossimale della cravatta ovaia e del lato distale della cravatta vaginale, lasciando il corno uterino legato con le suture su entrambe le estremità. Trasferire il corno uterino nel piatto dissezione rivestito in gomma siliconica e riempito con PSS freddo (4 ° c). Indipendentemente dal fatto che sia selezionato il corno destro o sinistro, mantenete lo stesso lato per la selezione in ogni esperimento per coerenza.Nota: per l’anestesia fetale, i cuccioli sono conservati in PSS ghiacciato. Pertanto, la temperatura PSS all’interno della camera di dissezione viene mantenuta dal bagno circolante refrigerato o la camera dissezione deve essere mantenuta sul ghiaccio.Nota: a questo punto la diga anestetizzata può essere eutanizzata per approvazione del protocollo IACUC di laboratorio. In questo caso, l’eutanasia avviene tramite pneumotorace (tagliando il diaframma) e la rimozione del cuore materno. Spingere delicatamente un perno dissezione attraverso il corno uterino nella gomma siliconica, con il lato ovario a sinistra e il lato vaginale a destra per visualizzare la vascolarizzazione uterina. Questo stabilizzerà l’utero e impedirà il movimento del tessuto durante la dissezione dello scomparto fetale. Selezionare un’unità materna-placenta-fetale centrale al corno e ligare l’arteria uterina e la vena con le forbici chirurgiche. Tagliare il muscolo uterino prossimale e distale alla placenta e al feto selezionati. Il muscolo uterino può essere retratto tirando a lato; è importante lasciarlo intatto, ma tirarlo lontano da coprire il cucciolo fetale.Nota: la selezione dell’unità materna-placenta-fetale deve essere basata sulla lunghezza del segmento dell’arteria uterina su entrambi i lati dell’arteria arcuata. Segmenti più lunghi permetteranno una maggiore riuscita della cannulazione. Utilizzando pinze sottili e forbici, rimuovere la membrana amniotica dalla superficie fetale della placenta, avendo cura di evitare il cordone ombelicale. Svelare e ligare il cordone ombelicale per separare il cucciolo fetale. Identificare l’arteria ombelicale (vaso più spessa) e la vena (vaso più sottile). Contrassegnare la vena ombelicale per facilitarne l’identificazione tagliandolo leggermente più corto dell’arteria ombelicale. Separare delicatamente l’arteria ombelicale e la vena l’una dall’altra. L’intera unità placentare, compresa la vascolarizzazione uterina, il muscolo uterino, la placenta e il cordone ombelicale, può essere tagliata e rimossa. 4. perfusione placentare Mantenere il flusso sanguigno anatomico mantenendo il corretto orientamento distale-prossimale dell’arteria uterina, collocare l’unità placentare (composta da vascolarizzazione uterina, muscolo uterino, placenta e cordone ombelicale) nella camera di vaso isolata modificata riempita con PSS caldo e ossigenato. Utilizzando una coppia di pinze sottili in ogni mano, cannulare le estremità prossimali e distali dell’arteria uterina sulle Micropipette di vetro. Fissare saldamente l’arteria uterina utilizzando il legante di sutura in nylon sterile precedentemente fissato sulla micropipetta.Nota: possono essere necessari anelli a due tiranti (nodo); Tuttavia, un singolo anello di cravatta consente una maggiore regolazione. Cannulare l’arteria ombelicale (flusso sanguigno fetale-materno) sull’ago 23 G (più grande) e fissarlo con sutura di seta intrecciata nera. Cannulare la vena ombelicale (flusso sanguigno materno-fetale) sull’ago smussato da 25 G (più piccolo) e fissarlo con sutura di seta intrecciata nera. Spostarsi alla stazione di perfusione placentare e riempire tutti i rubinetti e i tubi per evitare bolle d’aria. Collegare tutti i tubi secondo la Figura 2. Collocare piccole imbarcazioni di pesatura sotto la cannulazione distale dell’arteria uterina materna e la cannulazione dell’ago della vena ombelicale fetale per catturare l’effluente che emergerà durante la procedura. Accendere la pompa peristaltica, il regolatore di pressione e il monitor di pressione e aprire il rubinetto di arresto per consentire il flusso di fluido attraverso il tubo verso il trasduttore di pressione, ma non ancora alla placenta. Aumentare lentamente la pressione a 80 mm Hg. Lentamente girare il rubinetto alla placenta per aprire e guardare per le perdite all’interno della camera e intorno ai legami.Nota: se la pompa peristaltica è in funzione ad alta velocità, rivalutare la cannulazione uterina prossimale e i legami per le perdite di fluido. Se identificate, le fughe devono essere sanate. Si noti anche, mentre la pressione dell’arteria uterina media rimarrà costante (impostata su 80 mmHg), la portata del fluido può essere variabile a seconda delle risposte fisiologiche vascolari e placentare. La quantificazione del flusso del fluido può essere identificata come variabile sperimentale in risposta all’esposizione xenobiotica. Ruotare il rubinetto di arresto per consentire il flusso di fluido nell’arteria ombelicale. Impostare la pressione a circa 50 mmHg, che può essere implementata con una pompa peristaltica (Figura 3) o una colonna idrostatica. Riempire tutti i serbatoi (uterine, ombelicali e superfusate) per mantenere il volume fluido durante l’esperimento.Nota: una volta iniziata la perfusione ed è in corso l’esperimento, i cuccioli anestetizzati rimasti nel piatto dissezione possono essere valutati per la vitalità toccando i cuccioli con pinze per suscitare una risposta neurologica. L’espirazione dei cuccioli avverrà attraverso l’isterectomia del corno uterino; l’eutanasia può essere completata attraverso protocolli approvati IACUC. In questo caso, aprendo il sacco amniotico nel PSS freddo e creando un pneumotorace tagliando le costole. 5. esperimento finto Dopo la cannulazione e l’inizio della perfusione PSS, lasciare i tessuti equilibrare per 30 min per consentire la vascolarizzazione di adattarsi al nuovo flusso di fluido. Aspirare l’effluente da una pipetta e salvarlo in un tubo di microcentrifuga corrispondentemente etichettato. Dopo l’equilibratura, stabilire la perfusione di base raccogliendo gli effluenti per 10 minuti da entrambe le imbarcazioni di pesatura in provette per microcentrifuga e misurando il volume di fluido che emerge attraverso l’arteria uterina e la vena ombelicale. Avviare la raccolta dei campioni a intervalli di 10 minuti raccogliendo gli effluenti dall’arteria uterina distale e dalla vena ombelicale. Ad esempio, somministrare una dose di bolo di 900 μl di nanoparticelle di polistirene con etichetta di 20 Nm (8 x 1014 particelle/ml) sospese nel 0,01% di tensioattivi alla linea che irrora l’arteria uterina per identificare il passaggio del decorso del tempo di xenobiotico nanoparticelle attraverso la barriera placentare.Nota: questi campioni di effluenti consentiranno la misurazione di contaminanti all’interno del fluido (xenobiotico, farmacologico o metabolita) e forniscono il tasso di flusso del fluido attraverso l’arteria uterina o attraverso la placenta e nello scomparto fetale ( Figura 4). Dopo l’infusione in bolo, raccogliere campioni dall’arteria uterina distale e dall’effluente fetale della vena ombelicale ogni 10 minuti per un totale di 180 minuti dopo l’infusione. 6. pulizia dell’apparecchiatura Dopo ogni esperimento, rimuovere l’unità placentare dalle pipette. Tutte le suture possono essere salvate per essere riutilizzate in esperimenti futuri. Il tessuto placentare può essere salvato per ulteriori studi istologici o meccanicistici. Pulire tutti i tubi e le cannule del sistema di perfusione con 70% di etanolo seguito da acqua distillata e asciugare sottovuoto.Nota: se i tubi o le pipette iniziano a scolorirsi o a comparire danneggiate, sostituire prima dell’esperimento successivo. Inoltre, dopo che una coorte sperimentale è completa (ad esempio, tutti gli studi relativi a un singolo contaminante), sostituire tutti i tubi all’interno della camera per evitare contaminazioni incrociate.