Высокое разрешение 3D Изображение бешенства вирусной инфекции в Solvent-очищенных мозговой ткани
Summary
Новые, иммуноспотенцом совместимые методы очистки тканей, как конечная 3D-изображения растворителя очищенных органов позволяют 3D визуализации бешенства вирус инфекции головного мозга и его сложной клеточной среды. Толстые, антитела помечены ломтиками ткани мозга сделаны оптически прозрачными для увеличения глубины изображения и для включения 3D-анализа с помощью конфокальной лазерной сканирующей микроскопии.
Abstract
Визуализация инфекционных процессов в тканях и органах с помощью иммуномаркировки является ключевым методом в современной инфекционной биологии. Способность наблюдать и изучать распределение, тропизм и обилие патогенных микроорганизмов внутри тканей органов дает ключевые данные о развитии и прогрессировании болезней. Используя обычные методы микроскопии, иммуномаркировка в основном ограничивается тонкими секциями, полученными из парафина или замороженных образцов. Однако ограниченная плоскость 2D-изображений этих тонких секций может привести к потере важной информации о сложной структуре инфицированного органа и клеточном контексте инфекции. Современные многоцветные, иммуносно-совместимые методы очистки тканей теперь обеспечивают относительно быстрый и недорогой способ изучения высокообъемных 3D-изображений стеков зараженной вирусом ткани органов. Подвергая ткани органических растворителей, она становится оптически прозрачной. Это соответствует рефракционным индексам образца и в конечном итоге приводит к значительному сокращению рассеяния света. Таким образом, в сочетании с длинными свободными целями рабочего расстояния, большие секции ткани размером до 1 мм могут быть изображены обычными конфокальной лазерной сканирующей микроскопией (CLSM) с высоким разрешением. Здесь мы описываем протокол для нанесения визуализации глубоких тканей после очистки тканей для визуализации распространения вируса бешенства в инфицированных мозгах для изучения таких тем, как вирусный патогенез, распространение, тропизм и нейровторжение.
Introduction
Обычные методы гистологии в основном опираются на тонкие участки тканей органов, которые могут по своей сути обеспечить только 2D-понимание сложной 3D-среды. Хотя это возможно в принципе, 3D-реконструкция из серийных тонких секций требует требовательных технических трубопроводов как для нарезки, так и для последующего выравнивания силико приобретенных изображений1. Кроме того, бесшовная реконструкция z-томов после нарезки микротомов имеет решающее значение, так как механические и вычислительные артефакты могут оставаться из-за неоптимальной регистрации изображений, вызванной неоверплавлением плоскостей изображения, вариациями окрашивания и физическими разрушение тканей, например, лезвием микротома. В отличие от этого, чистая оптическая нарезка нетронутых образцов толстой ткани позволяет приобрести перекрывающиеся плоскости изображения (перевыборка) и, таким образом, облегчает 3D-реконструкцию. Это, в свою очередь, очень полезно для анализа инфекционных процессов в сложных популяциях клеток (например, нейронных сетей в контексте окружающих глиальных и иммунных клеток). Однако, присущие препятствия толстых секций ткани включают рассеяние света и ограниченное проникновение антител в ткани. В последние годы, различные методы были разработаныи оптимизированы для преодоления этих вопросов 2,3,4,5,6,8 , 9 До 9 , 10 Лет , 11 Год , 12 Лет , 13. По существу, целевые ткани становятся оптическипрозрачными при лечении либо с aqueous 2,3,4,6,7 ,8,9 или органических растворителей на основе10,11,12,13 решений. Внедрение 3DISCO (3D-изображения органов, очищенных от растворителя)11,12 и его преемника uDISCO (конечная 3D-изображение органов, очищенных от растворителя)13 обеспечило относительно быстрый, простой и недорогой инструмент с отличные возможности очистки. Основными компонентами клирингового протокола являются органические растворители терт-бутанол (TBA), бензиловый спирт (BA), бензил бензоат (BB) и дифениловый эфир (DPE). Разработка и добавление iDISCO (иммуномаркировка с поддержкой 3D-изображения органов, очищенных от растворителя)14, совместимого протокола иммуносохранения, стало еще одним преимуществом перед существующими методами и позволило провести маркировку антигенов в глубоких тканях интерес, а также длительное хранение иммунозапятнанных образцов. Таким образом, сочетание iDISCO14 и uDISCO13 позволяет с высоким разрешением изображения антител помечены белки в больших разделах тканей (до 1 мм) с использованием обычных CLSM.
Сохранение сложной структуры органа во всех трех измерениях особенно важно для тканей мозга. Нейроны составляют очень разнородную клеточную субпопуляцию с очень разнообразными 3D морфологиями на основе их невритовых проекций (рассмотрено Masland15). Кроме того, мозг состоит из ряда отсеков и подотсеков, каждый из которых состоит из различных клеточных субпопуляций и их соотношений, включая глиальные клетки и нейроны (обзор фон Бартхолд и др.16). Как нейротропный вирус, вирус бешенства (RABV, рассмотренный Fooks et al.17)в первую очередь заражает нейроны, используя свой транспортный механизм для передвижения в ретроградном направлении вдоль аксонов от основного места инфекции до центральной нервной системы (ЦНС). Описанный здесь протокол(рисунок 1А) позволяет иммуноспотеченно-помощь обнаружения и визуализации RABV и RABV-инфицированных клеток в больших, согласованных стеков изображений, полученных из инфицированных тканей мозга. Это позволяет объективно, 3D высокого разрешения оценки инфекционной среды. Это применимо к ткани мозга из различных видов, может быть выполнена сразу после фиксации или после длительного хранения образцов в параформальдегиде (PFA), и позволяет хранения и повторного изображения окрашенных и очищенных образцов в течение нескольких месяцев.
Protocol
Representative Results
Discussion
Возрождение и дальнейшее развитие методов очистки тканей в последние годы2,3,4,5,6,7, 9 До 9 , 10 Лет , 11 Год <sup…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Авторы благодарят Томаса Меттенлейтера и Верену те Камп за критические прочтения рукописи. Эта работа была поддержана Федеральной инициативой передового опыта Мекленбурга Западной Померании и Европейским социальным фондом (ESF) Грантом Коинфектом (ESF/14-BM-A55-0002/16) и интрамуральным грантом на совместные исследования лиссавирусов на Институт Фридриха-Леффлера (Ri-0372).
Materials
| Reagents | |||
| Benzyl alcohol | Alfa Aesar | 41218 | Clearing reagent |
| Benzyl benzoate | Sigma-Aldrich | BB6630-500ML | Clearing reagent |
| Dimethyl sulfoxide | Carl Roth | 4720.2 | Various buffers |
| Diphenyl ether | Sigma-Aldrich | 240834-100G | Clearing reagent |
| DL-α-Tocopherol | Alfa Aesar | A17039 | Antioxidant |
| Donkey serum | Bio-Rad | C06SBZ | Blocking reagent |
| Glycine | Carl Roth | 3908.2 | Background reduction |
| Goat serum | Merck | S26-100ML | Blocking reagent |
| Heparin sodium salt | Carl Roth | 7692.1 | Background reduction |
| Hydrogen peroxide solution (30 %) | Carl Roth | 8070.2 | Sample bleaching |
| Methanol | Carl Roth | 4627.4 | Sample pretreatment |
| Paraformaldehyde | Carl Roth | 0335.3 | Crystalline powder to make fixative solution |
| Sodium azide | Carl Roth | K305.1 | Prevention of microbial growth in stock solutions |
| tert-Butanol | Alfa Aesar | 33278 | Sample dehydration for tissue clearing |
| TO-PRO-3 | Thermo Fisher | T3605 | Nucleic acid stain |
| Triton X-100 | Carl Roth | 3051.2 | Detergent |
| Tween 20 | AppliChem | A4974,0500 | Detergent |
| Miscellaneous | |||
| 5 mL reaction tubes | Eppendorf | 0030119401 | Sample tubes |
| Coverslip, circular (diameter: 22 mm) | Marienfeld | 0111620 | Part of imaging chamber |
| Coverslip, circular (diameter: 30 mm) | Marienfeld | 0111700 | Part of imaging chamber |
| Hypodermic needle (27 G x ¾” [0.40 mm x 20 mm]) | B. Braun | 4657705 | Filling of the imaging chamber with clearing solution |
| RTV-1 silicone rubber | Wacker | Elastosil E43 | Adhesive for the assembly of the imaging chamber |
| Ultimaker CPE 2.85 mm transparent | Ultimaker | 8718836374869 | Copolyester filament for 3D printer to print parts of the imaging chamber |
| Technical equipment and software | |||
| 3D printer | Ultimaker | Ultimaker 2+ | Printing of imaging chamber |
| Automated water immersion system | Leica | 15640019 | Software-controlled water pump |
| Benchtop orbital shaker | Elmi | DOS-20M | Sample incubation at room temperature (~ 150 rpm) |
| Benchtop orbital shaker, heated | New Brunswick Scientific | G24 Environmental Shaker | Sample incubation at 37 °C (~ 150 rpm) |
| Confocal laser scanning microscope | Leica | DMI 6000 TCS SP5 | Inverted confocal microscope for sample imaging |
| Fiji | NIH (ImageJ) | open source software (v1.52h) | Image processing package based on ImageJ |
| Long working distance water immersion objective | Leica | 15506360 | HC PL APO 40x/1.10 W motCORR CS2 |
| Vibratome | Leica | VT1200S | Sample slicing |
| Workstation | Dell | Precision 7920 | CPU: Intel Xeon Gold 5118 GPU: Nvidia Quadro P5000 RAM: 128 GB 2666 MHz DDR4 SSD: 2 TB |
| Primary antibodies | |||
| Goat anti-RABV N | Friedrich-Loeffler-Institut | Monospecific polyclonal goat anti-RABV N serum, generated by goat immunization with baculovirus-expressed and His-tag-purified RABV nucleoprotein N Dilution: 1:400 |
|
| Rabbit anti-GFAP | Dako | Z0334 | Polyclonal antibody (RRID:AB_10013382) Dilution: 1:100 |
| Rabbit anti-MAP2 | Abcam | ab32454 | Polyclonal antibody (RRID:AB_776174) Dilution: 1:250 |
| Rabbit anti-RABV P 160-5 | Friedrich-Loeffler-Institut | Monospecific polyclonal rabbit anti-RABV P serum, generated by rabbit immunization with baculovirus-expressed and His-tag-purified RABV phosphoprotein P (see reference 23: Orbanz et al., 2010) Dilution: 1:1,000 |
|
| Secondary antibodies | |||
| Donkey anti-goat IgG | Thermo Fisher Scientific | depending on conjugated fluorophore | Highly cross-absorbed Dilution: 1:500 |
| Donkey anti-mouse IgG | Thermo Fisher Scientific | depending on conjugated fluorophore | Highly cross-absorbed Dilution: 1:500 |
| Donkey anti-rabbit IgG | Thermo Fisher Scientific | depending on conjugated fluorophore | Highly cross-absorbed Dilution: 1:500 |
| Goat anti-mouse IgG | Thermo Fisher Scientific | depending on conjugated fluorophore | Highly cross-absorbed Dilution: 1:500 |
| Goat anti-rabbit IgG | Thermo Fisher Scientific | depending on conjugated fluorophore | Highly cross-absorbed Dilution: 1:500 |
Referenzen
- Pichat, J., Iglesias, J. E., Yousry, T., Ourselin, S., Modat, M. A Survey of Methods for 3D Histology Reconstruction. Medical Image Analysis. 46, 73-105 (2018).
- Chung, K., et al. Structural and molecular interrogation of intact biological systems. Nature. 497 (7449), 332-337 (2013).
- Hama, H., et al. ScaleS: an optical clearing palette for biological imaging. Nature Neuroscience. 18 (10), 1518-1529 (2015).
- Ke, M. T., Fujimoto, S., Imai, T. SeeDB: a simple and morphology-preserving optical clearing agent for neuronal circuit reconstruction. Nature Neuroscience. 16 (8), 1154-1161 (2013).
- Kuwajima, T., et al. ClearT: a detergent- and solvent-free clearing method for neuronal and non-neuronal tissue. Development. 140 (6), 1364-1368 (2013).
- Susaki, E. A., et al. Whole-brain imaging with single-cell resolution using chemical cocktails and computational analysis. Cell. 157 (3), 726-739 (2014).
- Susaki, E. A., et al. Advanced CUBIC protocols for whole-brain and whole-body clearing and imaging. Nature Protocols. 10 (11), 1709-1727 (2015).
- Yang, B., et al. Single-cell phenotyping within transparent intact tissue through whole-body clearing. Cell. 158 (4), 945-958 (2014).
- Treweek, J. B., et al. Whole-body tissue stabilization and selective extractions via tissue-hydrogel hybrids for high-resolution intact circuit mapping and phenotyping. Nature Protocols. 10 (11), 1860-1896 (2015).
- Dodt, H. U., et al. Ultramicroscopy: three-dimensional visualization of neuronal networks in the whole mouse brain. Nature Methods. 4 (4), 331-336 (2007).
- Erturk, A., et al. Three-dimensional imaging of the unsectioned adult spinal cord to assess axon regeneration and glial responses after injury. Nature Medicine. 18 (1), 166-171 (2011).
- Erturk, A., et al. Three-dimensional imaging of solvent-cleared organs using 3DISCO. Nature Protocols. 7 (11), 1983-1995 (2012).
- Pan, C., et al. Shrinkage-mediated imaging of entire organs and organisms using uDISCO. Nature Methods. 13 (10), 859-867 (2016).
- Renier, N., et al. iDISCO: a simple, rapid method to immunolabel large tissue samples for volume imaging. Cell. 159 (4), 896-910 (2014).
- Masland, R. H. Neuronal cell types. Current Biology. 14 (13), 497-500 (2004).
- von Bartheld, C. S., Bahney, J., Herculano-Houzel, S. The search for true numbers of neurons and glial cells in the human brain: A review of 150 years of cell counting. The Journal of Comparative Neurology. 524 (18), 3865-3895 (2016).
- Fooks, A. R., et al. Rabies. Nature Reviews Disease Primers. 3, 17091 (2017).
- WHO. WHO Expert Consultation on Rabies, Third Report. WHO Technical Report Series. , (2018).
- CDC. . Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories, 5th Edition. US Department of Health and Human Services. , (2009).
- Arnold, M. M., et al. Effects of fixation and tissue processing on immunohistochemical demonstration of specific antigens. Biotechnic & Histochemistry. 71 (5), 224-230 (1996).
- Webster, J. D., Miller, M. A., Dusold, D., Ramos-Vara, J. Effects of prolonged formalin fixation on diagnostic immunohistochemistry in domestic animals. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 57 (8), 753-761 (2009).
- Werner, M., Chott, A., Fabiano, A., Battifora, H. Effect of formalin tissue fixation and processing on immunohistochemistry. The American Journal of Surgical Pathology. 24 (7), 1016-1019 (2000).
- Orbanz, J., Finke, S. Generation of recombinant European bat lyssavirus type 1 and inter-genotypic compatibility of lyssavirus genotype 1 and 5 antigenome promoters. Archives of Virology. 155 (10), 1631-1641 (2010).
