억제되지 않은 기압 변량 을 통해 노화 마우스에서 호흡 패턴을 얻는 방법
Summary
억제되지 않은 기압 적당층 은 깨어있는 마우스에서 호흡의 패턴을 정량화하는 데 사용됩니다. 표준화된 프로토콜 아래에 있는 15s 세그먼트는 조용한 호흡의 연장된 기간과 유사한 값을 표시한다는 것을 보여줍니다. 이 방법론은 또한 챔버에서 첫 번째 시간 동안 무호흡증과 증강 호흡의 정량화를 허용합니다.
Abstract
억제되지 않은 기압 적당층 (UBP)은 호흡 빈도, 조수 부피 및 미세 환기가 일상적으로보고되는 마우스에서 호흡 패턴을 정량화하는 방법입니다. 또한 중앙 무호흡증과 보강 호흡의 존재를 포함하여 호흡의 신경 출력에 관한 정보를 수집 할 수 있습니다. UBP를 위한 중요한 고려사항은 호흡 도전에 대한 반응을 해명하기 위하여 불안하거나 활동적인 행동의 최소한의 충격으로 호흡 세그먼트를 얻는 것입니다. 여기에서, 우리는 조용한 호흡의 더 긴 시합을 기다리는 것에 필적하는 나이 든 마우스에서 짧고 조용한 기준선을 장악할 수 있는 프로토콜을 제시합니다. 짧은 시간 세그먼트의 사용은 마우스의 몇몇 긴장이 점점 흥분하거나 불안할 수 있고, 조용한 호흡의 더 긴 기간이 적당한 기간 안에 달성되지 않을 수 있기 때문에, 가치가 있습니다. 우리는 UBP 챔버에 22 개월 된 마우스를 배치하고 취득하는 데 2-3 시간을 했다 더 긴 10 분 조용한 호흡 기간에 분 60-120 사이의 네 개의 15 의 조용한 호흡 세그먼트를 비교했다. 우리는 또한 30 분 숙고 기간에 따라 조용한 호흡 세그먼트 전에 중앙 무호흡증 및 증강 호흡의 수를 얻었습니다. 우리는 조용한 호흡의 10 분이 훨씬 짧은 15 s 의 지속 시간을 사용하는 것과 비슷하다는 것을 보여줍니다. 또한, 이러한 15s의 조용한 호흡 세그먼트에 이르는 시간은 중앙 기원의 무호흡증에 관한 데이터를 수집하는 데 사용할 수 있습니다. 이 프로토콜은 조사자가 일정 시간 내에 호흡 패턴 데이터를 수집할 수 있게 해주며 흥분성 행동의 증가된 양을 나타낼 수 있는 마우스에 대해 조용한 기준선 측정을 실현할 수 있게 합니다. UBP 방법론 자체는 호흡 패턴 데이터를 수집하는 유용하고 비침습적 인 방법을 제공하고 마우스가 여러 시간 지점에 걸쳐 테스트 할 수 있습니다.
Introduction
UBP는 호흡 패턴1,2,2,3,,4의평가를위한 일반적인 기술입니다. 이 방법에서, 마우스는 주 챔버 (동물이 보관되는 곳)와 기준 챔버 사이의 압력 차이가 값을 얻기 위해 기압계를 통해 여과되는 폐쇄 챔버에 배치됩니다. 결과 UBP 설치는 비침습적이고 억제되지 않으며 마취 또는 수술의 필요 없이 호흡 측정을 평가할 수 있습니다. 또한 이 기술은 시간이 지남에 따라 동일한 마우스에서 여러 측정이 필요한 연구에 적합합니다. 호흡 주파수, 조수 부피 및 미세 환기와 같은 변수는 단일 시험 또는 여러 번의 시험을 통해이 방법으로 정량화 될 수 있습니다. 전신 UBP는 또한 피크 흐름과 호흡 주기 기간의 측정을 제공합니다. 이러한 매개 변수는 함께 호흡 패턴을 정량화합니다. 기록된 호흡 추적을 통해 데이터를 검토하고 주어진 기간 내에 표시되는 중앙 무호흡증 수를 계산할 수 있습니다. 이 카운트는 조수 부피 및 흡기 시간의 분석과 함께 호흡 패턴의 다른 변화를 측정하는 데 사용할 수 있습니다.
폐 생리학적 파라미터의 직접적인 평가를 위해 여러 비침습적 과염 기법이 존재하는 반면, 전신 UBP는 마우스에 최소한의 과도한 스트레스로 호흡 기능을 스크리닝하는 방법을 허용한다. 조수 중견 유량 측정을 이용하고 또한 비침범성인 헤드 아웃 과다 모그래피는 다른 많은 유형의 과다 모그래피 (예 : 이중 챔버 과다 모그래피)와 마찬가지로 구속에 의존합니다. 이러한 방법은 기도 응답성을 측정하기 위해 설치류 모델에서 사용되었지만5,목 칼라 또는 작은 구속 튜브의 사용은 적응하고 휴식 수준으로 호흡을 반환하기 위해 마우스 (대 다른 종)를 더 오래 걸릴 수 있습니다.
최적의 공기 호흡 세그먼트를 얻는 것은 기준선 비교를 위한 중요한 고려 사항입니다. 상업적으로 이용 가능한 과다 모그래피 시스템의 사용이 증가함에 따라 많은 실험실에서 호흡 패턴 데이터를 수집할 수 있습니다. 중요한 것은, 호흡의 패턴은 수집 기간 내내, 특히 마우스를 위해 가변적입니다. 즉, 실험자의 교육 수준이 결과를 혼동하지 않도록 하는 수단으로 기준 분석을 표준화할 필요가 있습니다. 공기 호흡 세그먼트를 수집하는 방법에는 여러 가지가 있으며, 실험 설계 간의 변화의 한 영역역할을 합니다. 한 예로 챔버1내에서 이전에 정의된 시간 집합을 따르는 최종 10-30분의 데이터를 평균화하는 반면, 다른 방법은 마우스가 5-10분6동안눈에 띄게 진정될 때까지 기다리는 것을 포함한다. 후자는 2-3 h를 달성 하기 위해 걸릴 수 있습니다 및 경우에 따라, 마우스가 충분히 오랫동안 진정 되지 않은 경우 재판을 포기 해야 할 수 있습니다. 이 관심사는 관찰된 행동이 더 불안하고 흥분하는 마우스의 긴장에 대한 특히 중요한 고려사항입니다 7. 이 마우스는 챔버 환경에 적응하는 데 더 오래 걸릴 수 있으며 짧은 시간 동안만 침착하게 유지합니다. 기준선 수집에 전념하는 시간을 제한하여 각 마우스의 챔버 시간을 표준화합니다.
실험자는 마우스의 휴식 동작 값을 포괄하는 적절한 기준선을 획득하지만 적시에 발생하는 것이 중요합니다. 따라서, 이 보고서의 목적은 마우스에서 호흡 매개 변수에 대한 짧은 조용한 기준 값을 얻기 위해 사용되는 방법에 대한 설명을 제공하는 것입니다. 또한, 우리는 무호흡증과 증강 호흡이 챔버에서 첫 번째 시간 동안 정량화 될 수 있다고보고합니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
프로토콜은 마우스의 조용한 호흡 기준선에 관한 정보를 제공뿐만 아니라 중앙 무호흡증과 증강 호흡에 대한 데이터를 수집합니다. 대표적인 결과는 10분 의 조용한 기준선이 오래된 마우스의 코호트에 대한 4개의 15s 시합의 평균에 비교될 때 호흡의 유사한 패턴을 가지고 있다는 것을 보여줍니다. 중요한 것은, 15s 시합은 통계적으로 다르지 않으며, 이 단은 Levene의 시험을 사용하여 서로 에 있는 …
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
저자들은 안젤라 르, 사라 루비, 마리사 미키가 동물 식민지를 유지하는 일에 대해 감사를 표하고 싶습니다. 이 작품은 1R15 HD076379 (L.R.D.), 3R15 HD076379 (CNR을 지원하는 L.R.D.) 및 자연 과학의 McDevitt 학부 연구 펠로우십 (BEE)에 의해 지원되었습니다.
Materials
| Carbon Dioxide Analyzer | AEI Technologies | CD-3A | |
| Carbon Dioxide Sensor | AEI Technologies | P-61B | |
| Computer | must be compliant with Ponemah requirements | ||
| Drierite beads | PermaPure LLC | DM-AR | |
| Flow Control | AEI Technologies | R-1 | vacuum |
| Flowmeter | TSI | 4100 | need one per chamber and one for vacuum |
| Gas Mixer | MCQ Instruments | GB-103 | |
| Gas Tanks | Haun | 100% oxygen, 100% carbon dioxide, 100% nitrogen – food grade, or pre-mixed tanks for nomal room air and gas challenges | |
| Oxygen Analyzer | AEI Technologies | S-3A | |
| Oxygen Sensor | AEI Technologies | N-22M | |
| Polyurethane Tubing | SMC | TUS 0604 Y-20 | |
| Ponemah Software | DSI | ||
| Small Rodent Chamber | Buxco/DSI | ||
| Thermometer (LifeChip System) | Destron-Fearing | any type of thermometer to take accurate body temperatures is appropriate, but the use of implantable chips allows for minimal disturbance to animal for taking several body temperature measurements while the animal is still in the UBP chamber | |
| Transducers | Validyne | DP45 | need one per chamber |
| Whole Body Plethysmography System | Data Science International (DSI) | Includes ACQ-7700, pressure/temperature probes, etc. |
Referenzen
- DeRuisseau, L. R., et al. Neural deficits contribute to respiratory insufficiency in Pompe disease. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (23), 9419-9424 (2009).
- Ogier, M., et al. Brain-derived neurotrophic factor expression and respiratory function improve after ampakine treatment in a mouse model of Rett syndrome. Journal of Neuroscience. 27 (40), 10912-10917 (2007).
- Ohshima, Y., et al. Hypoxic ventilatory response during light and dark periods and the involvement of histamine H1 receptor in mice. American Journal of Physiology-Regulatory Integrative and Comparative Physiology. 293 (3), 1350-1356 (2007).
- van Schaik, S. M., Enhorning, G., Vargas, I., Welliver, R. C. Respiratory syncytial virus affects pulmonary function in BALB/c mice. Journal of Infectious Diseases. 177 (2), 269-276 (1998).
- Glaab, T., Taube, C., Braun, A., Mitzner, W. Invasive and noninvasive methods for studying pulmonary function in mice. Respiratory Research. 8, (2007).
- Loeven, A. M., Receno, C. N., Cunningham, C. M., DeRuisseau, L. R. Arterial Blood Sampling in Male CD-1 and C57BL/6J Mice with 1% Isoflurane is Similar to Awake Mice. Journal of Applied Physiology. , (2018).
- Receno, C. N., Eassa, B. E., Reilly, D. P., Cunningham, C., DeRuisseau, L. R. The pattern of breathing in young wild type and Ts65Dn mice during the dark and light cycle. FASEB Journal. 32 (1), (2018).
- Committee for the Update of the Guide for the Care and Use of Laboratory Animals, Inistitute fpr Laboratory Animal Research, Division on Earth and Life Studies, National Research Council of the National Academies. . Guide for the Care and Use of Laboratory Animals, 8th edition. , (2011).
- Receno, C. N., Glausen, T. G., DeRuisseau, L. R. Saline as a vehicle control does not alter ventilation in male CD-1 mice. Physiological Reports. 6 (10), (2018).
- Shanksy, R. M. Sex differences in behavioral strategies: Avoiding interpretational pitfalls. Current Opinion in Neurobiology. 49, 95-98 (2018).
- Kopp, C. Locomotor activity rhythm in inbred strains of mice: implications for behavioural studies. Behavioural Brain Research. 125 (1-2), 93-96 (2001).
- Teske, J. A., Perez-Leighton, C. E., Billington, C. J., Kotz, C. M. Methodological considerations for measuring spontaneous physical activity in rodents. American Journal of Physiology-Regulatory Integrative and Comparative Physiology. 306 (10), 714-721 (2014).
- Kabir, M. M., et al. Respiratory pattern in awake rats: Effects of motor activity and of alerting stimuli. Physiology & Behavior. 101 (1), 22-31 (2010).
- Terada, J., et al. Ventilatory long-term facilitation in mice can be observed during both sleep and wake periods and depends on orexin. Journal of Applied Physiology. 104 (2), 499-507 (2008).
- Friedman, L., et al. Ventilatory behavior during sleep among A/J and C57BL/6J mouse strains. Journal of Applied Physiology. 97 (5), 1787-1795 (2004).
- Drorbaugh, J. E., Fenn, W. O. A barometric method for measuring ventilation in newborn infants. Pediatrics. 16 (1), 81-87 (1955).
- Seifert, E. L., Mortola, J. P. The circadian pattern of breathing in conscious adult rats. Respiration Physiology. 129 (3), 297-305 (2002).
- Receno, C. N., Roffo, K. E., Mickey, M. C., DeRuisseau, K. C., DeRuisseau, L. R. Quiet breathing in hindlimb casted mice. Respiratory Physiology & Neurobiology. , 10 (2018).
