Nitropeptid profilering og identifikation illustreret af angiotensin II
Summary
Proteomisk profilering af tyrosin-nitrerede proteiner har været en udfordrende teknik på grund af den lave overflod af 3-nitrotyrosin modifikation. Her beskriver vi en ny metode til tilsætning af nitropeptid og profilering ved hjælp af angiotensin II som model. Denne metode kan udvides til andre in vitro -eller in vivo -systemer.
Abstract
Protein nitrering er en af de vigtigste post-translationelle modifikationer (PTM) på tyrosin rester og det kan induceres ved kemiske handlinger af reaktive oxygenarter (ROS) og reaktive nitrogen arter (RNS) i eukaryotiske celler. Præcis identifikation af nitrerings steder på proteiner er afgørende for forståelsen af de fysiologiske og patologiske processer relateret til protein nitrering, såsom inflammation, aldring og kræft. Da de nitro-holdige proteiner er af lav overflod i cellerne selv under inducerede forhold, er der ikke udviklet universelle og effektive metoder til profilering og identificering af protein nitreringssteder. Her beskriver vi en protokol for tilsætning af nitropeptid ved hjælp af en kemisk reduktions reaktion og biotin mærkning, efterfulgt af høj opløsning massespektrometri. I vores metode kan nitropeptidderivater identificeres med høj nøjagtighed. Vores metode udviser to fordele i forhold til de tidligere rapporterede metoder. Første, dimethyl mærkning bruges til at blokere den primære Amin på nitropeptider, som kan bruges til at generere kvantitative resultater. For det andet anvendes en disulfid obligation indeholdende NHS-biotin reagens til tilsætning, som kan reduceres yderligere og alkyleres for at forbedre detektionssignalet på et massespektrometer. Denne protokol er blevet anvendt med succes på model peptid angiotensin II i det aktuelle papir.
Introduction
Nitrering af tyrosin rester i proteiner til dannelse af 3-nitrotyrosin regulerer mange biologiske processer. På grund af de forskellige kemiske egenskaber mellem tyrosin og 3-nitrotyrosin, et nitreret protein kan have forstyrres signalering aktivitet1,2. Derfor er det vigtigt at udvikle metoder, der kan berige og identificere nitrerings steder på proteiner effektivt. Da 3-nitrotyrosin er en lav overflod modifikation på proteiner i forhold til andre former for PTM, såsom fosforylering og acetyl lation, det er udfordrende at identificere endogene nitrering steder direkte fra cellelinjer eller vævsprøver. Ikke desto mindre er metoden til brug af massespektrometri (MS) til at karakterisere fragmenterings mønstret for nitrotpeptid blevet udviklet (f. eks. Zhan & Desiderio3), som lægger fundamentet for nye metoder til nitroproteomik.
I øjeblikket er et berignings trin efterfulgt af MS den mest effektive strategi for nitropeptid-profilering4,5. Berignings metoderne kan inddeles i to klasser. En klasse er baseret på antistoffer, der kan genkende 3-nitrotyrosin specifikt, mens den anden klasse er baseret på den kemiske afledningen, der reducerer en Nitro gruppe til en Amin gruppe4,5. For den antistof-baserede metode anvendes nitrotyrosinaffinitet kolonne til berigelse, hvorfra elueret materiale er yderligere løst og analyseret af høj opløsning MS6,7. For den kemiske aflednings baserede metode skal amingrupperne ved N-endepunkt for peptid eller lysin blokeres i første trin enten ved at acetyl-, isobarisk-Tags for relative og absolutte kvantitation (itraq) eller tandem Mass Tags (TMT) reagenser. Næste, en reduktionssystem bruges til at reducere nitrotyrosin til amino tyrosin efterfulgt af at ændre den nydannede Amin gruppe, som omfatter biotin ligation, sulphydryl peptid konvertering, eller andre typer af tagging systemer8,9, 10,11. De fleste af de hidtidige protokoller er baseret på in vitro -over-nitrerede proteiner i stedet for endogent nitrerede proteiner.
I nærværende undersøgelse er der udviklet en modificeret procedure for kemisk afsaetning af nitrotyrosin til tilsætning og identifikation af nitropeptid, hvilket viser øget følsomhed under MS-påvisning og er egnet til kvantificerings formål. Vores nylige undersøgelse anvender denne metode i biologiske systemer identificeret, at nitrering af lymfocyt-specifikke protein tyrosinkinase (LCK) på Tyr394 af RNS fremstillet af myeloid-afledte suppressor celler (MDSCs) spiller en vigtig rolle i immunsuppression af tumormikromiljøet12. Derfor kan vores metode til identifikation af nitropeptid også anvendes på komplekse biologiske prøver. Her beskriver vi vores protokol ved hjælp af model peptid angiotensin II, som fragmenterings mønstret er kendt og udbredt i nitroprotemiske undersøgelser8,9,10,11, som et eksempel.
Protocol
Representative Results
Discussion
Protokollen her beskriver tilsætning af nitropeptid og profilering. Ved hjælp af angiotensin II som model peptid, illustrerede vi den procedure, der er vist i figur 1. Efter at have fået Nitro-angiotensin II, bør den primære Amin på peptid blokeres for at undgå yderligere Amin konjugering, som er et af de mest kritiske trin i protokollen. I den nuværende protokol bruges dimethyl-mærkning til at blokere de primære aminer af to grunde: for det første gør den det muligt at erhverve …
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbejde blev støttet af American Cancer Society institutions forskning Grant IRG-14-195-01 (M. Sharon stack er Principal Investigator; X.L. er en under modtager investigator). Denne publikation blev muliggjort med delvis støtte fra Grant Numbers KL2 TR002530 og UL1 TR002529 (A. Shekhar, PI) fra National Institutes of Health, National Center for fremrykning af translationelle videnskaber, klinisk og translational Sciences Award. X. L. er modtager af Indiana CTSI KL2 Young Investigator Award. S. F. er understøttet af Walther Cancer Foundation fremme grundlæggende Cancer tilskud. X. W. understøttes af National Natural Science Foundation of China General program (Grant No. 817773047).
Materials
| Acclaim pepmap 100 C18 column | Thermo-Fisher | 164534 | |
| 1 M TEAB solution | Sigma-Aldrich | T7408 | |
| 50% hydroxylamine | Thermo-Fisher | 90115 | |
| Acetonitrile | Thermo-Fisher | A955 | MS Grade |
| dithiothreitol | Sigma-Aldrich | 43819 | |
| formaldehyde | Sigma-Aldrich | F8775 | Molecular Biology Grade |
| formaldehyde-D2 | Toronto Research Chemicals | F691353 | |
| formic acid | Sigma-Aldrich | 695076 | ACS reagent |
| Fusion Lumos mass spectrometer | Thermo | ||
| isoacetamide | Sigma-Aldrich | I1149 | |
| Methanol | Thermo-Fisher | A456 | MS Grade |
| NHS-S-S-bition | Thermo-Fisher | 21441 | |
| Oasis HLB column (10 mg) | Waters | 186000383 | |
| peroxynitrite | Merck-Millipore | 516620 | |
| sodium cyanoborohydrite | Sigma-Aldrich | 42077 | PhamaGrade |
| sodium dithionate | Sigma-Aldrich | 157953 | Technical Grade |
| Streptavidin Sepharose | GE Healcare | GE17-5113-01 | |
| Ultimate 3000 nanoLC | Thermo |
Referenzen
- Radi, R. Nitric oxide, oxidants, and protein tyrosine nitration. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101, 4003-4008 (2004).
- Radi, R. Protein tyrosine nitration: biochemical mechanisms and structural basis of functional effects. Accounts of Chemical Research. 46, 550-559 (2013).
- Zhan, X., Desiderio, D. M. MALDI-induced fragmentation of leucine enkephalin, nitro-Tyr-leucine enkaphalin, and d5-Phe-nitro-Tyr-leucine enkephalin. Int. J Mass Spectrometry. 287, 77-86 (2009).
- Batthyány, C., et al. Tyrosine-Nitrated Proteins: Proteomic and Bioanalytical Aspects. Antioxidants & Redox Signaling. 26, 313-328 (2017).
- Feeney, M. B., Schöneich, C. Proteomic approaches to analyze protein tyrosine nitration. Antioxidants & Redox Signaling. 19, 1247-1256 (2013).
- Zhan, X., Desiderio, D. M. Nitroproteins from a human pituitary adenoma tissue discovered with a nitrotyrosine affinity column and tandem mass spectrometry. Analytical Biochemistry. 354, 279-289 (2006).
- Zhan, X., Wang, X., Desiderio, D. M. Mass spectrometry analysis of nitrotyrosine-containing proteins. Mass Spectrometry Reviews. 34, 423-448 (2015).
- Abello, N., Barroso, B., Kerstjens, H. A. M., Postma, D. S., Bischoff, R. Chemical labeling and enrichment of nitrotyrosine-containing peptides. Talanta. 80, 1503-1512 (2010).
- Chiappetta, G., et al. Quantitative identification of protein nitration sites. Proteomics. 9, 1524-1537 (2009).
- Dekker, F., Abello, N., Wisastra, R., Bischoff, R. Enrichment and detection of tyrosine-nitrated proteins. Current Protocols in Protein Science. , (2012).
- Zhang, Q., et al. A method for selective enrichment and analysis of nitrotyrosine-containing peptides in complex proteome samples. Journal of Proteome Research. 6, 2257-2268 (2007).
- Feng, S., et al. Myeloid-derived suppressor cells inhibit T cell activation through nitrating LCK in mouse cancers. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115, 10094-10099 (2018).
- Boersema, P. J., Raijmakers, R., Lemeer, S., Mohammed, S., Heck, A. J. Multiplex peptide stable isotope dimethyl labeling for quantitative proteomics. Nature Protocol. 4, 484-494 (2009).
