Análise de análogos de ácido Iofenoxico em pequeno mangusto indiano (Herpestes auropunctatus) sera para uso como um marcador biológico de vacinação contra a raiva oral

O vírus da raiva (RABV) é um único lyssavirus encalhado do sentido negativo, e circula entre espécies diferentes do reservatório dos animais selvagens dentro das ordens Carnivora e Chiroptera. Várias espécies de mangusto são reservatórios de RABV, e o pequeno mangusto indiano (Herpestes auropunctatus) é o único reservatório em Porto Rico e outras ilhas caribenhas no hemisfério ocidental^1,2,3 . O controle da circulação de RABV em reservatórios de vida selvagem é tipicamente realizado através de uma estratégia de vacinação contra a raiva oral (ORV). Nos Estados Unidos (EUA), esta atividade de gestão é coordenada pelo USDA/APHIS/Wildlife Services programa nacional de gestão da raiva (NRMP)⁴. Atualmente não há vida selvagem ORV programa existe em Porto Rico. Pesquisa em vacinas contra a raiva e vários tipos de isca para mangustos tem sido conduzido com resultados promissores sugerindo um programa ORV para mangustos é possível^5,6,7,8.

O monitoramento do impacto da ORV depende da estimativa da captação de iscas por espécies-alvo, o que tipicamente envolve a avaliação de uma alteração na soroprevalência de anticorpos RV. No entanto, essa estratégia pode ser desafiadora em áreas com programas ativos de ORV de vida selvagem ou em áreas onde o VD é enzoótico e níveis de fundo de anticorpos neutralizantes RABV (RVNA) estão presentes em espécies de reservatórios. Em tais situações, um biomarcador incluído na isca ou a matriz de isca externa pode ser útil.

Vários marcadores biológicostêm sido utilizados para monitorizar a captação de iscas em numerosas espécies, incluindo guaxinins (Procyon lotor)^9,10, Estats (Mustela arminho)^11,12, texugos europeus ( Meles) ¹³, javalis selvagens (Sus scrofa)¹⁴, pequenos mangustos indianos¹⁵ e cães da pradaria (cynomysludovicianus)^16,17, entre outros. Nos EUA, as iscas operacionais de ORV freqüentemente incluem um biomarcador de tetraciclina a 1% na matriz de isca para monitorar a captação de iscas^18,19. Entretanto, os inconvenientes ao uso do tetraciclina incluem uma preocupação crescente sobre a distribuição dos antibióticos no ambiente e que a deteção do tetraciclina é tipicamente invasora, exigindo a extração ou a destruição do dente do animal para obter o osso amostras²⁰. A rhodamina B foi avaliada como um marcador em uma variedade de tecidos e pode ser detectada usando luz ultravioleta (UV) e fluorescência no cabelo e bigodes^10,21.

O ácido iofenoxico (IPA) é um pó branco, cristalino que tem sido utilizado para avaliar o consumo de iscas em coiotes (Canis latrans)²², Arctic Fox (Vulpes lagopus)²³, Red Fox (VulpesVulpes)²⁴, guaxinins ⁹ anos de ^{, 25}, javali¹⁴, cervos vermelhos (Cervus elaphus scoticus)²⁶, Badgers europeus¹² e furões (M. furo)²⁷, entre várias outras espécies de mamíferos. Os tempos de retenção do IPA variam por espécies de menos de duas semanas em alguns marsupiais^28,29, para pelo menos 26 semanas em ungulados²⁶ e mais de 52 semanas em cães domésticos (Canis lupus familiaris)³⁰. Os tempos de retenção também podem ser dependentes da dose³¹. O ácido iofenoxico liga-se fortemente à albumina sérica e foi historicamente detectado pela medição dos níveis de iodo no sangue³². Esta aproximação indireta foi suplantada por métodos da cromatografia líquida de capacidade elevada (HPLC) para medir diretamente concentrações do ácido iophenoxic com deteção UV³³, e eventualmente com cromatografia líquida e espectrometria maciça (LCMS) ^34,35. Para este estudo, foi desenvolvida uma cromatografia líquida altamente sensível e seletiva com método de espectrometria de massas em tandem (LC-MS/MS) que utiliza o monitoramento de múltiplas reações (MRM) para quantificar dois análogos do ácido iofenoxico. Nosso objetivo foi usar este método LC-MS/MS para avaliar a capacidade de marcação de 2-(3-hidroxi-2, 4, 6-triiodobenzilo) ácido propanoico (metil-IPA ou me-IPA) e 2-(3-hidroxi-2, 4, 6-triiodobenzilo) ácido butanóico (etil-IPA ou et-IPA) e quando entregues em um ORV isca para Mongooses em cativeiro.

Os Mongooses foram capturados vivos em armadilhas da gaiola iscas com as salsichas fumadas comercialmente disponíveis e o óleo de peixes. Mongooses foram alojados em individuais 60 cm x 60 cm x 40 cm gaiolas de aço inoxidável e alimentados com uma ração diária de ~ 50 g alimento de gato seco comercial, suplementado duas vezes por semana com uma coxa de frango disponível comercialmente. A água estava disponível ad libitum. Nós entregamos dois derivados de IPA, de ethyl-IPA e de methyl-IPA, aos mangustos cativos em baits do placebo ORV. Todas as iscas foram compostas de um blister de 28 mm x 20 mm x 9 mm com revestimento externo (doravante “matriz de isca”) contendo ovo de frango em pó e gelatina (tabela de materiais). As iscas continham 0,7 mL de água ou derivado do IPA e pesaram aproximadamente 3 g, dos quais ~ 2 g foi a matriz de isca externa.

Nós oferecemos 16 mangustos cativas et-IPA em três concentrações: 0,14% (2,8 mg et-IPA em ~ 2 g de matriz de isca; 3 machos [m], 3 fêmeas [f]), 0,4% (2,8 mg et-IPA em 0,7 ml de volume de blisters; 3M, 3F) e 1,0% (7,0 mg de etil-IPA em 0,7 ml de volume de blisters; 2m , 2f). A dose global de 2,8 mg corresponde a uma taxa de dose de 5 mg/kg^27,36 e baseia-se num peso médio de mangusto de 560 g em Porto Rico. Nós selecionamos 1% como a concentração a mais elevada como a pesquisa sugere a aversão do gosto a alguns biomarcadores pode ocorrer em concentrações > 1% em algumas espécies³⁷. Nós oferecemos somente a dose de 1% no bloco de bolha como a floculação impediu o soluto de dissolver-se no solvente suficientemente para ser incorporado uniformente na matriz da isca. Um grupo controle (2m, 1f) recebeu iscas cheias de água estéril e sem IPA. Nós oferecemos iscas para mangustos na parte da manhã (~ 8 a.m.) durante ou antes da alimentação de sua ração de manutenção diária. Restos de isca foram removidos após aproximadamente 24 horas. Foram coletadas amostras de sangue antes do tratamento, um dia após o tratamento e, em seguida, semanalmente até 8 semanas após o tratamento. Nós Anestesiaram mangustos pela inalação do gás do isoflurano e coletamos até 1,0 ml do sangue inteiro pelo punção venosa da veia craniana oca como descrita para furões³⁸. Nós centrifugados amostras inteiras do sangue, sera transferido aos cryovials e armazenamos-os em-80 ° c até a análise. Nem todos os animais foram amostrados durante todos os períodos de tempo para minimizar os impactos do sangue repetido se baseia na saúde dos animais. Os animais de controle foram amostrados no dia 0, depois semanalmente por até 8 semanas após o tratamento.

Nós entregamos o me-IPA em três concentrações: 0, 35% (0,7 MGS), 0, 7% (1,4 MGS) e 0,14% (2,8 MGS), todos incorporados na matriz da isca, com 2 machos e 2 fêmeas por o grupo do tratamento. Dois machos e duas fêmeas receberam iscas cheias de água estéril e sem IPA. Os tempos de oferecimento da isca e a anestesia do Mongoose são descritos acima. Nós coletamos amostras de sangue antes do tratamento no dia 1, e então semanalmente até 4 semanas após o tratamento.

Foram testados dados de concentração sérica para normalidade e médias estimadas para concentrações séricas de IPA de diferentes grupos de tratamento. Utilizou-se um modelo linear misto para comparar as concentrações médias de et-IPA sérica agrupadas em indivíduos. O tipo da isca (matriz/bloco de bolha) era um efeito fixo além do que o dia experimental, visto que a identificação animal era um efeito aleatório. Todos os procedimentos foram executados utilizando software estatístico comum (tabela de materiais) e a significância foi avaliada em α = 0, 5.