Dans Vitro génération du Somite dérivés de Human induit Pluripotent Stem cellules

Tous les protocoles expérimentaux impliquant CISP humaine ont été approuvées par le Comité d’éthique de la faculté de médecine et la Graduate School of Medicine, Université de Kyoto. 1. humain CISP préparation avant Induction Remarque : La culture humaine CISP (201B7-PAX3-GFP) sur artère SNL cellules16 avec primate ES cellules additionné à 4 ng/mL facteur de croissance fibroblastique base humaine recombinante (FGF2) et 0,5 % la pénicilline et la streptomycine (ci-après désignée comme moyen de CSEh, voir Le tableau 1). Lorsque le rapport de confluence atteint 70 à 80 %, le passage des cellules comme décrit précédemment17. Passage des humains CISP sur SNL alimentation cellules17 Pour passage, ajouter PBS dans le récipient de culture cellulaire et rincer les cellules. Puis, retirez le PBS (, ce processus va être dénommé lavage avec du PBS). Ajouter 1 mL de solution CTK (voir tableau 1) à température ambiante (RT) et attendez jusqu’à ce que les cellules nourricières SNL commencent à détacher le fond du plat. Enlever la solution CTK et puis laver deux fois avec du PBS. Ajouter 1 mL de milieu de CSEh (voir tableau 1) dans le plat, puis gratter les cellules à l’aide d’un racloir et recueillir dans un tube conique de 15 mL. Pipetez doucement le contenu cinq fois en utilisant un embout µL 1 000 et puis les transférer vers une autre boite remplie de CSEh moyen. Utiliser un rapport de 1:4 à 01:10, selon le rapport de confluence avant passage de split. En outre, varier le volume de milieu de CSEh selon l’importance du plat (par exemple, 3 mL pour un plat de 6 cm, 8 mL pour un plat de 10 cm). Incuber le CISP humain à 37 ° C et 5 % de CO2. Changer le quotidien moyen (sauf pour le lendemain de passage) et la culture des cellules jusqu’à la prochaine procédure de passaging. Feeder-free culture de CISP humain avant l’induction de la PSMRemarque : pour minimiser l’effet de facteurs de croissance sécrétés par des cellules nourricières SNL, de la culture le CISP humaine dans des conditions sans chargeur avec un milieu de culture cellulaire exempt d’alimentation (voir tableau 1) sur les solutions de la matrice extracellulaire (mec) (voir tableau 1) plat couché pendant 3 jours avant l’induction de la PSM. Jour -4 (4 jours avant de commencer l’induction PSM) Pour préparer le plat de revêtement solution ECM, ajouter 4 mL de solution d’ECM sur un plat de 10 cm à 4 ° C durant la nuit.Remarque : Placer la solution ECM sur la glace lors de la préparation. Jour -3 Tout d’abord, retirer le plat de la solution ECM et ajoutez 8 mL de milieu de culture cellulaire exempt d’engraissement. Pour démarrer l’engraissement-free culture, laver une fois avec du PBS pour rincer les cellules cultivées. Ajouter 1 mL de solution CTK à ta jusqu’à ce que les cellules nourricières SNL commencent à détacher le fond du plat.Remarque : La microscopie permet de confirmer que toutes les cellules nourricières sont détachent du fond. Enlever la solution CTK et laver avec du PBS, deux fois, afin que toutes les cellules nourricières SNL sont entièrement enlevés. Ajouter 1 mL de milieu de culture cellulaire exempt d’engraissement dans le plat, puis gratter les cellules à l’aide d’un racloir et à leur rassemblement dans un tube conique de 15 mL. Doucement la pipette le contenu trois fois, avec une pointe de 1 000 µL, puis transférer dans un plat de solution-enduit 10 cm nouveau ECM (préparé au cours de l’étape 1.2.1). Utiliser un coefficient de fractionnement d’environ 1,2 à 1,4, selon le rapport de confluence avant chargeur-free culture. Incuber le CISP humain à 37 ° C et 5 % de CO2 pendant 3 jours, changeant le milieu jour -1. 2. PSM différenciation et l’isolement par cellule activée par Fluorescence triant (FACS) Différenciation de PSM (0 – jour 4) Aspirer le milieu de culture cellulaire exempt d’engraissement et ajoutez 8 mL de milieu d’induction de PSM (milieu de base au titre du MDP additionné de 10 µM SB431542, 10 µM CHIR99021, 2 µM DMH1 et 20 ng/mL FGF2, voient tableau 1).Remarque : Confluence de la cellule lors de l’ouverture de la différenciation de la PSM est critique pour l’efficacité de l’induction. La microscopie permet de confirmer que le rapport confluent est environ 30 %. Incuber les cellules à 37 ° C, avec 5 % de CO2, pour 4 jours, changeant la moyenne sur 3 jours. Récolte des cellules pour les FACS au jour 4 (section 2.2, ci-dessous). Isolement des cellules PSM positives DLL1 par cellule activée par fluorescence triant (FACS)Remarque : Voici une procédure pour la préparation de cellules avant FACS trier des cellules positives DLL1. Effectuer des FACS tri à l’aide d’un cytomètre en flux, selon le protocole du fabricant. Aspirez le milieu, puis laver avec du PBS. Par la suite, ajouter 1 mL de réactif de dissociation cellulaire et laisser pendant 3 min à température ambiante. Ajouter 4 mL de milieu de base au titre du MDP, gratter les cellules à l’aide d’un racloir et à leur rassemblement dans un tube conique de 15 mL. Compter le nombre de cellules à l’aide d’un compteur de cellules automatisées, puis centrifuger à 280 g pendant 3 min. Soigneusement retirer le surnageant par aspiration et remettre en suspension les cellules dans le tampon de FACS (voir tableau 1) à une concentration de 1,0 x 107 cellules/mL. Pour un échantillon de contrôle négatif (contrôle de l’isotype, soit par convention sans anticorps), transférer 50 µL dans un tube conique de 15 mL et ensuite suspendre avec 450 µL de tampon de FACS. Ajoutez l’anticorps DLL1 (voir Table des matières) dans une proportion de 1/200. Protéger le tube de lumière et de garder sur la glace pendant 30 min. Centrifuger à 280 x g pendant 3 min. Avec précaution, aspirer le surnageant et remettre en suspension dans un tampon de FACS (1,0 x 107 cellules/mL) additionné de 1 mg/mL DAPI. Transvaser dans un tube de prélèvement, incorporé avec une maille en nylon de 35 µm dans le capuchon pour le filtrage, puis placez le tube sur la glace jusqu’à ce que le tri est terminé. Effectuez la même procédure avec l’échantillon de contrôle négatif (étape 2.2.4). Effectuer le tri à l’aide d’un cytomètre en flux selon le protocole du fabricant. Recueillir les cellules positives de DLL1 triées dans un tube conique de 15 mL, contenant 4 mL de milieu de base au titre du MDP additionné de 10 µM de Y27632. Pour l’extraction de l’ARN totale, centrifuger à 280 g pendant 3 min puis remettre en suspension dans le tampon de lyse RNA et conserver à-30 ° C. Voir l’extraction de l’ARN, transcription inverse, RT-qPCR procédures (article 5.1) pour plus d’informations. Effectuer la différenciation SM en utilisant les cellules triées selon le dessous protocole (article 3). 3. SM différenciation de PSM Différenciation de cellules positives PSM triés DLL1 (jour 4 – jour 8) SMRemarque : préparer les plaques de 12 puits recouvert solution ECM le jour avant le tri des FACS. Pour préparer une plaque de 12 puits recouvert solution ECM, ajouter 1 mL de solution d’ECM dans chaque puits à 4 ° C et laisser une nuit. Conserver la solution ECM sur la glace lors de la préparation. Après l’étape 2.2.10, centrifuger à 280 x g pendant 3 min. Soigneusement aspirer le surnageant et remettre en suspension dans 1 mL de milieu d’induction SM (milieu de base au titre du MDP additionné de 10 µM SB431542 et 5 µM CHIR99021, voir tableau 1). Compter le nombre de cellules à l’aide d’un compteur de cellules automatisées. Semences 1,0 x 105 cellules sur chaque puits des ECM solution-enduit 12 plaques à puits contenant 1 mL de milieu d’induction SM additionné de 10 µM de Y27632. Incuber à 37 ° C, avec 5 % de CO2 pendant 4 jours jusqu’au jour 8. Changer le milieu ne contenant ne pas de Y27632 sur 5 jours (le jour après le tri des FACS) et 7 jours. Effectuer la différenciation des dérivés SM en utilisant des cellules de SM induits selon les protocoles ci-dessous. Pour l’extraction d’ARN totale de cellules SM induites, recueillir les cellules dans un tube conique de 15 mL et centrifuger à 280 x g pendant 3 min, puis remettre en suspension dans le tampon de lyse RNA et conserver à-30 ° C. 4. SM dérivés (DM, MYO, D, SCL, SYN) différenciation de SM Remarque : Afin de démontrer la compétence-plein de cellules SM, exécutez d’abord DM (dermomyotome) et l’induction de SCL (sclérotome) en conséquence à l’aide de cellules iPSC-SM. Par la suite, effectuent MYO (myotome) et l’induction de D (dermatome) en utilisant les cellules DM et conduite induction SYN (syndetome) en utilisant les cellules SCL. Voici les protocoles pour l’induction de chaque dérivé (DM, MYO, D, SCL et SYN) de cellules SM induites in vitro. DM la différenciation des cellules SM (jour 8 – jour 11) Aspirez le milieu, puis ajouter 1 mL de milieu d’induction DM (milieu basal de MDP additionné de 5 µM CHIR99021 et 10 ng/mL BMP4, voir tableau 1). Incuber les cellules à 37 ° C, avec 5 % de CO2, pendant 3 jours jusqu’à 11 jours. Changer la moyenne sur 10 jours (jour 2 de DM induction). Effectuent MYO et D à l’aide de la différenciation induite par DM cellules selon les protocoles ci-dessous. Différenciation des cellules DM (jour 11 – journée 41) MYO Aspirez le milieu, puis ajouter 1 mL de milieu d’induction MYO (milieu de base au titre du MDP additionné de 5 µM CHIR99021, voir le tableau 1). Incuber les cellules à 37 ° C, avec 5 % de CO2, pour 30 jours jusqu’à 41 jours. Changer le support tous les 3 jours. Différenciation des cellules (jour 11 – journée 20) de la DM D Aspirer le milieu, puis ajouter 1 mL de milieu d’induction D (milieu de base au titre du MDP additionné de 5 µM CHIR99021 et 10 ng/mL BMP4, voir tableau 1). Incuber les cellules à 37 ° C, avec 5 % de CO2, 9 jours jusqu’à 20 jours. Changer le support tous les 3 jours. Différenciation des cellules SM (jour 8 – jour 11) SCL Aspirez le milieu, puis ajouter 1 mL de milieu d’induction SCL (milieu de base au titre du MDP additionné de 100 nM SAG et 0,6 µM LDN193189, voir le tableau 1)14. Incuber les cellules à 37 ° C, avec 5 % de CO2, pendant 3 jours. Changer la moyenne sur 10 jours (induction 2 jour de SCL). Effectuer la différenciation SYN à l’aide de cellules SCL induites selon le protocole ci-dessous. Différenciation des cellules SCL (jour 11 – journée 32) SYNRemarque : préparer les plaques de 24 puits recouvert solution ECM la journée avant d’amorcer l’induction SYN. Pour préparer une plaque de 24 puits recouvert solution ECM, ajouter 0,5 mL de solution d’ECM dans chaque puits à 4 ° C et laisser une nuit. Conserver la solution ECM sur la glace lors de la préparation. Aspirez le milieu puis laver avec du PBS, puis ajouter 0,2 mL de réactif de dissociation cellulaire dans chaque puits et laisser pendant 3 min à température ambiante. Ajouter 0,8 mL de milieu de base au titre du MDP dans chaque puits puis raclez et recueillir toutes les cellules dans un tube conique de 15 mL. Centrifuger à 280 x g pendant 3 min. Soigneusement aspirer le surnageant et remettre en suspension dans 1 mL de SYN induction moyen-1 (milieu de base au titre du MDP additionné de 20 ng/mL FGF8, voir tableau 1), puis comptez le nombre de cellules à l’aide d’un compteur de cellules automatisées. Semences 5.0 x 104 cellules dans chaque puits des ECM solution-enduit 24 plaques à puits contenant 1 mL de SYN induction moyen-1. Incuber à 37 ° C, avec 5 % de CO2, pendant 3 jours. Le jour 14 (induction de la journée 3 de SYN), remplacez le support par SYN induction moyen-2 (milieu de base au titre du MDP additionné de 10 ng/mL BMP7 et 10 ng/mL TGFβ3, voir tableau 1). Incuber à 37 ° C, avec 5 % de CO2, pendant 18 jours jusqu’à 32 jours. Changer le support tous les 3 jours. 5. caractérisation des produits dérivés de la CISP Remarque : Lors de la différenciation, caractériser CISP humains dérivés utilisant quantitative PCR en temps réel (RT-qPCR), immunocytochimie (ICC), dosages immuno-enzymatiques (ELISA) et essais de stimulation étirement mécanique, en conséquence. Cellulaire, extraction d’ARN totale, transcription inverse et analyse quantitative de PCR (RT-qPCR) en temps réel Prélever des échantillons cellulaires (procédures 2.2.10, 3.1.6, 5.4.3) dans un tube de 1,5 mL, puis centrifuger à 280 g pendant 3 min. Retirez le surnageant, puis resuspendre dans 350 µL de tampon de lyse RNA, fourni par un kit d’extraction d’ARN total approprié. Extraire l’ARN total utilisant le kit selon le protocole du fabricant. Marche arrière transcrire l’isolé 1 µg d’ARN total au cDNA, selon le protocole du fabricant. Effectuer la RT-qPCR utilisant les enzymes appropriés, aux réactifs et amorces selon le protocole du fabricant. Les séquences d’amorces utilisées dans cette étude sont répertoriés dans le tableau 2. Immunocytochimie (ICC) Avant d’effectuer l’immunocytochimie avec des anticorps, fixer les cellules avec du paraformaldéhyde de 2 % à 4 ° C pendant 10 min et laver deux fois avec du PBS. Pour perméabilisation, incuber avec 0,2 % de méthanol ou 0,2 % polysorbate 20/PBS (ci-après dénommé PBS-T) à 4 ° C pendant 15 minutes. Retirez les réactifs perméabilisation et traiter les cellules avec un approprié blocage tampon ou 1 % bovine sérum albumine/PBS à 4 ° C pendant 60 min. Ajouter le premier anticorps dilué avec 10 % de tampon bloquant dans PBS-T et le déposer sur une machine vibrante à 4 ° C durant la nuit. Laver trois fois avec PBS-T (ajouter PBS-T et le placer sur la machine vibrante RT pendant 10 min). Ajouter le deuxième anticorps, dilué dans un tampon bloquant 10 % dans PBS-T et le déposer sur la machine vibrante RT pendant 60 min. Les premiers et deuxième anticorps pour ICC utilisé dans cette étude sont répertoriés dans le tableau 3.Remarque : A partir de cette étape, protéger le plat/plat de la lumière en l’enveloppant dans du papier. Laver deux fois avec du PBS-T. Pour compteur de coloration, ajouter 1/5000 DAPI dilué avec PBS et les placer sur la machine vibrante RT pendant 5 min. Enlever la solution DAPI et ajouter PBS dans chaque puits. Observer la coloration de cellules à l’aide d’un microscope à fluorescence. Vous pouvez également stocker le plat/plat à 4 ° C pendant environ 1 mois. Enzyme-linked Immunosorbent assay (ELISA) pour une analyse fonctionnelle de l’iPSC dérivé DRemarque : fibroblastes dermiques humains (HDF) sont disponibles dans le commerce. La culture de HDF en DMEM additionné de sérum de veau fœtal 10 % (voir tableau 1). Semences 1,0 x 105 cellules dérivées iPSC D et HDF sur plaques 24 puits contenant 1 mL de chaque milieu de culture (milieu d’induction D: D, HDF : DMEM additionné de sérum de veau fœtal 10 %). Après 3 jours de culture de cellules, collecter 100 µL de chaque support, placer dans un tube de 1,5 mL et conserver à 4 ° C. Effectuer la série de procédures, telles que l’ajout d’anticorps de détection et des anticorps secondaires, selon les instructions du fabricant et de quantifier le nombre de cibles en générant une courbe standard contre la concentration du contrôle échantillons de l’analyte. Test de stimulation étirement mécanique pour l’analyse fonctionnelle des dérivés iPSC SYNRemarque : tenocytes humains adultes sont disponibles dans le commerce (voir Table des matières). La culture humaine iPSC dérivés SYN et adulte tenocytes humaine sur une cellule qui s’étend de dispositif pour l’essai de stimulation étirement mécanique tel que décrit ci-dessous18,19. Utilisation SYN induction moyen-2 et tenocytes milieu de culture (voir Table des matières) comme milieu de culture pour chaque SYN dérivés iPSC et tenocytes humain adulte, respectivement. Après 24 h avant l’étirement, plaque 1,0 x 105 cellules dérivées iPSC SYN et humaine tenocytes sur caoutchouc de silicium évidement multi enduits solution ECM chambres, chacune avec une surface de culture de 1,5 x 1,5 cm (voir Table des matières). Positionnez les chambres de l’appareil pour la cellule qui s’étend et forcer monoaxial souche cyclique (0,5 Hz, 5 %) pendant 12 h. Pour l’extraction de l’ARN totale, ajouter 350 µL de tampon de lyse RNA, puis gratter et prélever les cellules dans un tube de 1,5 mL pour extraction de l’ARN totale et l’analyse ultérieure de RT-qPCR (voir procédure 5.1).