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Immunologie und Infektion

Menschliche Colonoid Monolagen Wechselwirkungen zwischen Erreger, Kommensalen und Host Darmepithel zu studieren

Published: April 09, 2019
doi:
10.3791/59357
, , ,
1Department of Internal Medicine,University of New Mexico Health Science Center, 2Department of Medicine, Division of Gastroenterology & Hepatology,Johns Hopkins University School of Medicine

Summary

Hier präsentieren wir Ihnen ein Protokoll zur menschlichen Kultur Enteroid oder Colonoid Monolagen, die intakten Barrierefunktion, Wirt epithelialen Mikrobiota Interaktionen auf die zelluläre und biochemische Ebene zu studieren.

Abstract

Menschliche 3-dimensionale (3D) Enteroid oder Colonoid Kulturen Krypta Basis Stammzellen abgeleitet sind derzeit die am weitesten fortgeschrittene ex Vivo Modell des Darmepithels. Aufgrund ihrer geschlossenen Strukturen und deutliche unterstützende extrazelluläre Matrix sind 3D Kulturen nicht ideal für Wirt-Pathogen-Studien. Enteroids oder Colonoids als epitheliale Monolagen auf durchlässigen Gewebekultur Membranen ermöglichen Manipulation beider luminalen angebaut werden können und basolateralen Zelloberflächen und begleitenden Flüssigkeiten. Diese verbesserte luminalen Oberfläche Zugänglichkeit ermöglicht Modellierung bakterielle-Wirt epitheliale Interaktionen wie die Schleim-abbauenden Fähigkeit der Enterohemorrhagic E. Coli (EHEC) am Kolon Epithel. Eine Methode für 3D Culture Fragmentierung, Monolage Aussaat und Ttransepitelialen elektrischen Widerstand (TER) Messungen zur Überwachung des Fortschritts in Richtung Konfluenz und Differenzierung werden beschrieben. Colonoid Monolage Differenzierung ergibt sezernierten Schleim, der durch die Immunfluoreszenz oder Immunoblotting Techniken studiert werden kann. Enteroid oder Colonoid Monolagen ermöglichen ganz allgemein eine physiologisch relevanten Plattform, spezifische Zellpopulationen zu bewerten, die durch Pathogene oder Kommensalen Mikrobiota ausgerichtet werden kann.

Introduction

Intestinale Organellen, Enteroids und Colonoids führten zu viele Fortschritte in der Stammzell-Verhalten, Darm Entwicklung, Barriere/Transportfunktion und zellulare Unterscheidung zu verstehen. 1 beschränkt jedoch 3D Culture das Studium der epithelialen-Erreger-Interaktion Hosts weil das Lumen nicht direkt erreichbar, Bakterien ist oder Virulenz Faktoren, es sei denn, die geschlossenen Strukturen Mikroinjektion ausgesetzt sind. 2 , 3 zusätzlich Materialien wie kleine Moleküle, Proteine, abgesondert oder Schleim kann nicht leicht von 3D Culture für die nachgelagerte Analyse abgetastet werden. Die Auswirkungen von Krankheitserregern auf epitheliale Barriere-Funktion4 und Ionen-Transport5 wurde in 3D Culture mit Fluoreszenzfarbstoffen und Zeitraffer Mikroskopie bewertet, aber Monolagen auf durchlässigen Gewebekultur unterstützt angebaut sind zugänglich zusätzliche Techniken wie TER Mess- und h Kammer/Spannung Klemme Aufnahme. 6 , 7

Zahlreiche Publikationen haben Protokolle für 2D- oder Monolayer Kultur des Enteroids/Colonoids beschrieben. Förderung der Epithelzelle Anlage gefunden Materialien enthalten Kollagen Hydrogele,8,9 0,1 % Gelatine,10 murinen Sarkom abgeleitet Basalmembran Dünnschicht-Matrix (BMM),11,12, 13 und menschlichen Kollagen IV. 6 , 7 , 14 , 15 , 16 , 17 Aussaat Ansätze umfassen mechanische Fragmentierung durch pipettieren,6,14,15 und/oder Dissoziation der Zelle Adhäsion Faktoren mit Trypsin,10,11 Dispase,13 oder EDTA. 9 ein paar Protokolle verwenden porenfrei Gewebekultur Kunststoffprodukte für die Aussaat, aber dies schränkt den basolateralen Zugriff, so dass die meisten Anwendungen abhängig von durchlässigen Gewebekultur Einsätze. Dokumentation der stabilen konfluierende Monolage Bildung und Pflege sehr unterschiedlich zu den Publikationen. Darüber hinaus Wachstum und Differenzierung Medien Kompositionen für menschliche Kulturen unterscheiden sich zwischen verschiedenen Gruppen und weiter zu entwickeln, da mehr Forscher übernehmen und anpassen die Methodik ihrer Anwendung und verfügbaren Ressourcen angepasst.

Um die Einschränkungen von 3D intestinalen epithelialen Culture in Wirt-Pathogen Interaktionen Studien zu beheben, stellen wir einen geänderten Protokoll zum Konvertieren von 3D menschliche Enteroids oder Colonoids in einem monomolekularen Film. Nach dem Erreichen der Konfluenz in einer Krypta-artigen unreifen Zustand, führt Entzug von Wachstumsfaktoren WNT3A, RSPO1 und Inhibitoren A-83-01 und SB-202190 zu Differenzierung Vertreter der kleinen Darm Villus oder Kolon Oberflächenepithel. Wir beschreiben die ideale Matrix, menschliche Kollagen Typ IV, um die Einsätze zu beschichten und einheitliche Enteroid oder Colonoid Fragmente für Beschichtung erhalten. Wir zeigen, dass dieses Protokoll eine konfluierende Monolage mit hohem produziert ter Colonoid Monolagen einer dicken apikalen Schleimschicht absondern Ex Vivo -Studien der Erreger-Schleim Interaktion via Immunoblotting oder Immunostaining ermöglicht. Ein veränderter Fixierung Verfahren der Kolon Schleimschicht für Immunostaining zu bewahren wird ebenfalls beschrieben. Diese Methode soll ein gefügig Modell, um die frühesten Darm Wirt-Pathogen Interaktionen bei der Infektion zu studieren.

Protocol

Dieses Protokoll basiert auf Studien, die zuvor von den Autoren veröffentlicht. 6 , 7 , 14 , 15 , 16 die folgenden Schritte sollten in einem sterilen Biosafety-Schrank mit richtigen aseptische Techniken durchgeführt werden. Alle Methoden, bei denen menschliche Exemplare wurden von der institutionellen Review Board der Johns Hopkins University School of Medicine (IRB NA_00038329) genehmigt. 1. Mantel Zelle Kultur Einsätze mit extrazellulären matrix 5 mL Lager Kollagen IV-Lösung (1 mg/mL) in 100 mM Essigsäure vorzubereiten. Bei 4 ° C für ca. 4 h stehen, vollständig Hydrat/auflösen lassen. Aliquoten Kollagen IV Lösung auf Lager und bei 4 ° C (≤ 1 Monat) oder-20 ° C (> 1 Monat) zu speichern. Unmittelbar vor der Beschichtung, verdünnen Sie Kollagen IV Vorratslösung in sterilen Gewebekultur Grade Wasser, eine Endkonzentration von 34 μg/mL. Für 24-Well-Platte Einsätze Zellkultur, Mantel, die jeweils mit 100 μl der Lösung, das entspricht 10 μg/cm2einsetzen. Inkubieren Sie die Platte in einem standard CO2 Gewebekultur Inkubator bei 37 ° C für ≥ 2 h, oder der Einfachheit halber versiegeln Sie die Plattenkanten mit Paraffin Film und inkubieren Sie bei 4 ° C über Nacht oder bis zu 1 Woche. (2) isolieren Sie Enteroids/Colonoids von 3D culture Hinweis: Enteroids oder Colonoids erstellt von Spender-Biopsien und fortgeschrieben wird in 3D Culture nach Standardprotokollen zuvor beschrieben. 14 , 18 kurz, Krypten von intestinalen Biopsien oder Resektionen über Chelat und mechanische Agitation geerntet werden. Die Krypten sind gewaschen, geerntet und in BMM überzogen. Ausbau-Medien (im Schritt 4.2 beschrieben) ist hinzugefügt, um die Kultur und ersetzt alle 2 Tage. 3D Culture-Bildung ist innerhalb von Stunden nach der Beschichtung sichtbar. Aspirieren das Kulturmedium von 24-Well-Platte und mit 1 mL eiskalte Ernte Lösung zu ersetzen (siehe Tabelle der Materialien) pro Bohrloch. Verwenden Sie Mini-Zelle Schaber zu verdrängen und Zerfall der Basalmembran Matrix Pellet, wobei besonderes Augenmerk auf jedes Material in der Nähe der gut Kanten. Schütteln Sie die Platte auf einem Orbitalschüttler bei ca. 200 u/min, 4 ° C für 30-45 min. 3. trennen Sie 3D Enteroids/colonoids Verwenden Sie ein P200 Einkanal-Pipette oder eine Multi-Kanal-Pipette mit sterilen Filterspitzen ausgestattet, um die Zellsuspension genannte. Bündeln Sie die Zelle Suspension(s) in einem konischen 15 mL-Fläschchen. Verwenden Sie mehrere Fläschchen, wenn vollständige Aussetzung Volumen > 6 mL. Fügen Sie ein gleiches Volumen an Advanced DMEM/F12 Medium mit 10 mM HEPES, L-Alanyl-L-Glutamin Dipeptid (1 X) und Penicillin-Streptomycin (1 X) (Wasch-Mittel). Invertieren die Röhre 3-4mal zu mischen. Zentrifuge bei 300 x g, 10 min, 4 ° C. Optional Aspirieren Mediums waschen und mit 0,5 mL/Well Trypsin zu ersetzen (siehe Tabelle der Materialien). Aufzuwirbeln Sie Colonoids mit einer Pipette P200, Röhrchen Sie die und legen Sie in einem 37 ° C Wasserbad für ca. 2 min. sofort den Schlauch zu entfernen, waschen Medium zu einem Endvolumen von 10 mL hinzufügen und wiederholen Sie die Zentrifugation wie in Schritt 3.3.Hinweis: Dieser Schritt möglicherweise vorzuziehen, wenn Verreibung nicht einheitlich große Fragmente führt. (4) plating die Enteroid/Colonoid-Aussetzung Wenn beschichtete Wendeschneidplatten bei 4 ° C gelagert wurden, equilibrate in einem 37 °C/5% CO2 Gewebekultur Inkubator für mindestens 30 min vor der Zelle Beschichtung. Für jeden Einsatz, verchromt werden bereiten Sie 1 mL warm (zwischen 25-37 ° C) Erweiterung Medium (EM) und 10 μM Y-27632 und 10 μM CHIR 99021 hinzufügen.Hinweis: EM besteht der Advanced DMEM/F12 mit B27 (1 X), 50 % WNT3A konditioniert, Medium, 15 % RSPO1 konditioniert Medium, 10 % Birne konditioniert Medium, 50 ng/mL menschlichen EGF, 500 nM A-83-01, 10 μM SB 202190, Antibiotikum/antimykotische cocktail (1 X), 10 mM HEPES, L-Alanyl-L-Glutamin Dipeptid (1 X) und Penicillin-Streptomycin (1 X) (siehe Tabelle der Materialien). Aspirieren das Waschen Medium aus der Tube, enthält die Zelle Pellet und Aufschwemmen in einem Volumen von EM ausreichen, um mindestens 100 μL/Insert ergeben. Aspirieren Sie Kollagen IV Lösung aus jeder Einsatz und waschen Sie zweimal mit 150 μL des Mediums waschen pro Einlage. Pipettieren 600 μL von EM in den Raum unterhalb jeder Einsatz. Pipettieren 100 μl Zellsuspension in jeder Einsatz. Die Platte in der Gewebekultur Inkubator zurück und lassen Sie ungestört für mindestens 12 h.Hinweis: Vermeiden Sie schütteln oder stark kippen die Platte, um zu verhindern, dass die ungleiche Verteilung von Colonoid Fragmenten auf der Membran einfügen. Überwachen der Zellhaftung und Verbreitung um konfluierende Monolage zu bilden, indem Sie die Platte auf einem Phasenkontrast-Lichtmikroskop unter einem 2.5 x-10 x Objektiv. Nach 1-2 Tagen sollte die meisten Fragmente der Kollagen-Matrix entsprechen. Aktualisieren Sie das Kulturmedium und Abbrechen Sie Behandlung mit Y-27632 und CHIR 99021. Weiterhin das Medium alle 2-3 Tage bis zum Zusammenfluss aktualisieren. Konfluenz ist in der Regel in 7-10 Tagen erreicht. 5. Maßnahme berührt elektrischer Widerstand Befestigen Sie das Elektrodenkabel und schalten die epitheliale Voltohmmeter (EVOM). Stellen Sie sicher, dass die Messfunktion Ohm eingestellt ist. Tauchen Sie die Elektrodenspitzen kurz in 70 % igem Ethanol und trocknen mit einem Labor-Gewebe. Equilibrate der Elektrode in 5 mL Medium waschen ca. 5 Minuten. Tauchen Sie die kürzere Elektrodenspitze Mittel-und einfügen und orientieren Sie die längere Elektrodenspitze in die untere Platte gut. Pflegen Sie die Elektrode in eine vollständige vertikale Ausrichtung bis EVOM Lesung relativ stabil ist, oder nicht länger als 60 s.Hinweis: Wenn die Elektrodenanordnung weit von vertikalen geneigt ist, oder die Spitzenhöhe ist falsch eingestellt, die kürzere Spitze kann kommen in Kontakt mit und die Zelle monomolekularen Film stören. Vergleichen Sie EVOM Messungen auf den Wert, der aus einem zellfreien einfügen untergetaucht in Kulturmedium, Fortschritt in Richtung Konfluenz oder Differenzierung zu bewerten. 6. Differenzierung konfluierende Enteroid/Colonoid Monoschichten Austausch von EM für Differenzierung Medium (DM), und weiterhin Medien alle zwei Tage bis zum 5. Tag aktualisieren. DM ist EM, die WNT3A, RSPO1, fehlt A-83-01 und SB-202190. TER um sicherzustellen, dass die Differenzierung verläuft erwartungsgemäß weiterhin. TER wird weiterhin in 1-5 Tagen der Differenzierung zu erhöhen. Monolayer können weiterhin TER zu erhöhen und Lebensfähigkeit über Tag 5-6 behalten aber maximal und die reproduzierbare Ergebnisse bei Tag 5-6 aufweisen. (7) bakterielle Infektion mit Kommensalen oder pathogenen E. coli Einen Tag vor der Durchführung der Infektion, waschen Sie und füttern Sie Monolagen mit antibiotikafreien EM oder DM. Verwenden Sie eine sterile Mikrobiologie-Schleife, um sanft reiben Sie die Oberfläche einer gefrorenen bakterielle Glycerin-Aktie und 2 mL LB Brühe zu impfen. Übertragen Sie das Rohr zu einem Standard schütteln Inkubator bei 37 ° C für 12-16 Uhr. 50 μL der Starterkultur in 5 mL frisches LB Brühe (1: 100) zu verdünnen und Inkubation mit Schütteln für 90 min weiter. Dies ergibt eine Log-Phase-Kultur mit einer Dichte von 105-106 Koloniebildenden Einheiten (KBE) / mL. Bestätigen Sie gegebenenfalls die Bakterienkonzentration durch Messung der optischen Dichte bei 600 nm (OD600) in einem Spektrophotometer. Spin-down die Bakterienkultur auf 12.000 x g für 10 min., überstand zu entfernen und erneut Bakterien in antibiotikafreien EM oder DM, eine Endkonzentration von 107 KBE/mL. Fügen Sie 10 μL Bakteriensuspension auf den Einsatz (Endkonzentration 106 KBE/mL). Pipettieren langsam zu mischen und nicht zu stören das extrazelluläre Schleimschicht. Die Platte in einer Gewebekultur-Inkubator für den Zeitraum der gewünschten Infektion zurück. (8) Fixierung zu bewahren und Immunostain Schleim Heben Sie die Zellkultur aus 24-Well-Platte fügt sorgfältig auf einem Labor-Tissue-Papier zu entfernen das apikale Medium, und wischen Weg externe Flüssigkeit klammerte sich an den Einsatz zu invertieren. Tauchen Sie in eine neue 24-Well-Platte des Einsatzes in einer 1:3-Lösung von Eisessig in absoluten Ethanol (Clarkes Lösung) für 10 min bei Raumtemperatur. Invertieren Sie die einfügen, um das Fixiermittel zu entfernen und die Zellen mit 1 X PBS-Puffer für 10 min. weiter mit standard Immunostaining Protokolle rehydrieren. Verwenden Sie eine Rasierklinge, um im Umkreis der einfügen-Membran geschnitten. Übertragen Sie die Membran auf einen Glas-Objektträger mit Pinzette und kleben Sie ein Deckglas mit Eindeckmedium. 9. Vorbereitung der Zelle Lysates immunoblotting Hinweis: Führen Sie folgende Schritte auf dem Eis oder in einem kalten Raum. Einmal einfügen Aspirat Medium und waschen mit PBS. Fügen Sie 150 μL Lyse Puffer mit Protease-Inhibitoren (siehe Tabelle der Materialien) auf den Einsatz und ca. 5-10 min. stehen lassen Lysis Puffer enthält 50 mM Tris pH 8, 150 mM NaCl, 1 % IGEPAL CA-630, 0,5 % Natrium Deoxycholate, 0,1 % SDS, 1: 100-Protease-Inhibitor cocktail. Verwenden Sie Schabeisen Mini-Zelle, um die Zellen aus dem Einfügen entfernen, dann mit einer Pipette P200 kurz die Aussetzung und den Transfer zu einem Microcentrifuge Schlauch genannte. Beschallen Sie die Suspension mit 5 x 1 s-Pulse bei 20 % Amplitude mit einer Microtip Sonde (siehe Tabelle der Materialien). Hinzuzufügen Sie SDS-PAGE laden Puffer, wenn sofort Elektrophorese oder Aliquote durchführen und speichern Sie Lysates bei-20 ° C.

Representative Results

Menschliche Enteroid und Colonoid Kulturen sind als 3D Strukturen gewachsen dann getrennt und für die Beschichtung auf menschliche Kollagen IV-beschichtete Zelle Kultur Einsätze fragmentiert. Der Fortschritt der Monolage Bildung ist leicht auf einer täglichen Basis über Hellfeld Mikroskopieren, Immunfluoreszenz-Färbung (Abbildung 1), und durch eine stetige Zunahme in Ttransepitelialen elektrischen Widerstand (TER) (Abbildung 2), überwacht widerspiegelt die Durchlässigkeit der engen Kreuzungen, Ionen und korreliert mit Monolage Konfluenz. TER eines leeren 24-Well-Einsatzes beträgt ca. 50-100 Ω·cm2, und bei Erreichen der Konfluenz erhöht sich auf etwa 400-500 Ω·cm2. Alle Epithelzellen in konfluierende Monolagen sind verbunden durch Knoten komplexe erkannt durch den F-Aktin-Ring in der Peripherie der Zelle (Abbildung 1). Monolayer in voller Wachstumsfaktor Medien repräsentieren das proliferative Krypta-ähnliche Epithel in erster Linie bestehend aus aktiv teilenden Zellen, die die Nukleosid enthalten analoge EdU (Abbildung 2). Entzug von Wachstumsfaktoren, WNT3A und RSPO1 fördert die Differenzierung führt zu Villus-wie Kulturen, die wuchernde Zellen fehlt. Differenzierte Monolagen Enterozyten (Enteroids) oder Colonocytes (Colonoids) enthalten und spezialisierte intestinale Epithelzellen zu entwickeln, wie in 3D Kulturen,18 inklusive Becher und Enteroendocrine Zellen gezeigt hat. 15 differenzierte Monolagen auch zeigen einen deutlichen Anstieg der TER (> 1000 Ω·cm2) (Abbildung 2), Reife tight Junctions angibt. In der normalen menschlichen Physiologie trennt die intestinale Epithelschicht Nährstoffe und die Mikrobe angereicherte luminalen Raum von der sterilen serosal Umgebung. Das Epithel regelt fest das Übersprechen zwischen diese zwei Fächer. Enteroid und Colonoid Monolagen bewahren diese Eigenschaft wichtig Abschottung, dargestellt durch die Proteomik-Analyse in Tabelle 1. Es gibt erhebliche Unterschiede zwischen der Proteinzusammensetzung im apikalen und basolateralen konditioniert Medien von differenzierten Enteroid Monolagen gesammelt. Zugriff auf der apikalen und basolateralen Seite ermöglicht für die Sammlung von beiden Überstände auf Zeit abhängigen Weise zur Messung der differenziellen Sekretion anderer Moleküle wie Zytokine und Chemokine. 15 , 17 Monolagen sind bequem und hoch reproduzierbare Modelle, die Änderungen im Protein-Expression mit Immunoblotting und Immunostaining erkennen. So ändert sich in Mucin 2 (MUC2) kann Ausdruck von ShRNA Zuschlag (KD) mit beiden Techniken (Abbildung 3) erfasst werden. Die ShRNA Transduktion wurde auf 3D Colonoids durchgeführt und in antibiotische Auswahl Medien beibehalten. Nach Überprüfung das KD, können Colonoids kontinuierlich als 3D Kulturen gepflegt bzw. als Monolagen um zu Versuchszwecken beschichtet werden. Darüber hinaus hat MUC2 KD keinen Einfluss auf die Effizienz der Monolayer-Bildung im Vergleich zum Wildtyp elterliche Colonoid Linie. Sammlung von Monolagen für Immunoblotting ist einfach und ähnelt der Protokolle für menschliche epitheliale Adenokarzinom abgeleitet Zelllinien beschrieben. In der Regel ca. 50 µg oder mehr des Gesamt-Protein aus einer einzigen 0,33 cm2 einfügen gewachsen Monolage extrahiert werden können. Wie in Abbildung 3gezeigt, MUC2 im undifferenzierten (UD) WT Colonoid Monolagen kaum nachweisbar ist aber hoch drückt sich in differenzierten (DF) WT Monolagen. MUC2 liegt unter dem Niveau der Erkennung in UD und DF Colonoid Monolagen mit MUC2 ShRNA ausgestrahlt. Wichtiger ist, sind Monolagen ein geeignetes Modell, Host-mikrobielle Wechselwirkungen an die apikale Oberfläche der Epithelien zu studieren. Colonoid Monolagen bilden einen dicken angefügten MUC2-Positive Schleimschicht auf Differenzierung, die nicht leicht durch Kommensalen durchdrungen ist E. Coli HS-Bakterien (Abbildung 4), ähnlich wie im normalen menschlichen Dickdarm vorgeschlagen worden ist. 19 aber Enterohemorrhagic E. Coli (EHEC), eine menschliche Kolon Erreger nachweislich die Fähigkeit haben, zerstören MUC2 angereicherte beigefügten Schleimschicht um die apikale Oberfläche des Epithels (Abbildung 4) zu erreichen. 14 , 20 verbleibenden MUC2 ist nur im Inneren der Becherzellen. Abbildung 1: Gründung des menschlichen Enteroid/Colonoid Monolagen. (A) Beispiel für Colonoid Fragmente nach der Auflösung der BMM und Verreibung. (B) Beispiel für Einsatz unmittelbar nach der Beschichtung Colonoid Fragmente. Skala bar (A-B) = 200 μm. Repräsentative (C) maximale Intensität Projektion und (D) konfokalen optischen Z-Profil mit den entsprechenden orthogonale Projektionen zeigen, dass Colonoid Fragmente auf menschliche Kollagen IV-beschichtete Filter Formular mehrere Monolage Inseln ausgesät 2-4 Tage nach Aussaat. Zellfreie Bereiche (Sternchen) sind erkennbar durch das Fehlen von Atomtests (Hoechst 33342, blau) und apikalen F-Aktin (grüne Phalloidin) Färbung in C und D. Vertreter (E) maximale Intensität Projektion und (F) konfokalen optischen Abschnitt mit der entsprechenden orthogonale Projektionen zeigen eine Monolage konfluierende Colonoid mit kontinuierlicher apikale Oberfläche erkannt durch F-Aktin Immunostaining ca. 1 Woche nach dem impfen. (G) hoher Vergrößerung eines repräsentativen Beihilfehöchstintensität Projektion und konfokalen optischen Abschnitt (H) mit den entsprechenden orthogonale Projektionen zeigen, dass Zellen in konfluierende Colonoid Monolagen bilden die F-Aktin-perijunctional Ringe (weiße Pfeilspitze) und einem unreifen apikalen Bürste Rand (gelber Pfeil Köpfe). Skala bar (C-H) = 20 μm. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur. Abbildung 2: Bewertung der Enteroid/Colonoid Monolage Differenzierung. (A) EdU (rot) Aufnahme zeigt einen fortschreitenden Verlust der Verbreitung während Jejunal Monolage Differenzierung. (B) durchschnittliche TER Messungen in konfluierende Jejunal Monoschichten in Expansion oder Differenzierung Medium. Fehlerbalken darzustellen SEM UD, undifferenzierten; DF, differenziert. Zahlen entsprechen Tage unter die angegebene Bedingung; UD1 war der erste Tag der Konfluenz, ca. 1 Woche nach der Aussaat. (C) UD Jejunal Monolagen haben breite, kürzere Zellen und eine weniger Reifen apikalen Aktin-basierte Pinsel Grenze als DF 5.Tag Jejunal Monolagen. Skala bar (A, C) = 50 μm. Alle Monolagen wurden dargestellt, mindestens 1 Woche nach dem säen und konfluierende vor Beginn der Differenzierung waren. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur. Abbildung 3: Wildtyp Colonoids und ShRNA ausgestrahlt Zuschlag (KD) Colonoids jeder Form konfluierende Monolagen. (A) repräsentative Bilder der Wildtyp (WT) menschlichen konfluierende Colonoid Monolage differenziert für 5 Tage und (B) in ähnlicher Weise gewachsen Monolagen abgeleitet MUC2 KD Colonoid Kulturen. Skala bar (A-B) = 50 µm (C) Vertreter Immunoblot Colonoid Kulturen ausgestrahlt mit Rührei ShRNA oder MUC2 ShRNA zeigt, dass die Änderungen im Protein-Expression durch KD durch Immunoblot quantitated werden können. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur. Abbildung 4: Enteroid/Colonoid Monolagen sind geeignete Modelle luminalen Mikrobe-Wirt Interaktionen zu studieren. (A) repräsentative Beihilfehöchstintensität Projektion und orthogonalen optische Teil einer Monoschicht Colonoid zeigt die Dicke apikalen MUC2-Positive Schleimschicht ist nicht durchlässig für E. Coli HS (schwarze Pfeilspitzen) sitzt an der apikalen Schleim Oberfläche. Die monomolekularen Film war für 6 Stunden mit 106 KBE/mL HS infiziert. (B) repräsentative Beihilfehöchstintensität Projektion des menschlichen Colonoid Monolage apikal mit EHEC (106 KBE/mL, 6 Stunden) infiziert. Skala bar (A-B) = 50 μm. (C) MUC2 Immunfluoreszenz Intensität Messungen zeigen eine signifikante Abnahme der MUC2 im EHEC-infizierten Colonoid Monolagen im Vergleich zu nicht infizierten Kontrollen. Fehlerbalken darzustellen SEM Klicken Sie bitte hier, um eine größere Version dieser Figur. Protein Zbl-Nummer Peptid-Fülle Basolateralen Medien Fettsäure-bindendes Protein, Leber [Homo Sapiens] NP_001434.1 1299 Profilin-1 [Homo Sapiens] NP_005013.1 797 Apolipoprotein A-IV Vorläufer [Homo Sapiens] NP_000473.2 744 Ecto-ADP-Ribosyltransferase 4 Vorläufer [Homo Sapiens] NP_066549.2 633 Glyceraldehyde-3-Phosphat-Dehydrogenase Isoform 1 [Homo Sapiens] NP_002037.2 (+ 1) 616 Serotransferrin Vorläufer [Homo Sapiens] NP_001054.1 (+ 1) 572 Vitamin-D-bindende Protein Isoform 3 Vorläufer [Homo Sapiens] NP_001191236.1 (+ 2) 567 Katalase [Homo Sapiens] NP_001743.1 427 Agrin Isoform 1 Vorläufer [Homo Sapiens] NP_940978.2 (+ 1) 377 Lactotransferrin Isoform 1 Vorläufer [Homo Sapiens] NP_002334.2 (+ 1) 262 Apikalen Medien Kleeblatt Faktor 3 Vorläufer [Homo Sapiens] NP_003217.3 326 Kleeblatt Faktor 1 Vorläufer [Homo Sapiens] NP_003216.1 304 Basalmembran-spezifische Heparan Sulfat Proteoglykan Kern Protein Isoform Vorläufer [Homo Sapiens] NP_001278789.1 (+ 3) 303 Filamin B Isoform 1 [Homo Sapiens] NP_001157789.1 (+ 2) 240 Kleeblatt Faktor 2 Vorläufer [Homo Sapiens] NP_005414.1 182 in malignen Gehirn Tumoren 1 Protein Isoform b Vorläufer [Homo Sapiens] gelöscht NP_015568.2 (+ 3) 169 Keratin, Typ II Zellskelett 1 [Homo Sapiens] NP_006112.3 157 Myosin-9 [Homo Sapiens] NP_002464.1 150 Aminopeptidase N Vorläufer [Homo Sapiens] NP_001141.2 (+ 1) 145 Agrin Vorläufer [Homo Sapiens] NP_940978.2 (+ 1) 112 Tabelle 1. Eine unvollständige Liste der Peptide identifiziert durch flüssige Chromatographie/Tandem Massenspektrometrie in apikalen und basolateralen Flüssigkeiten von abgetastet differenziert Jejunal Monolagen.

Discussion

Wichtige Parameter für erfolgreiche Bildung von Enteroid/Colonoid Monolagen beinhalten 1) gesund, wuchernden 3D Kulturen als Ausgangsmaterial; (2) Beschichtung der Zelloberfläche mit menschlichen Kollagen IV vor der Aussaat Monolayer Kultur einfügen; (3) die Fragmentierung von 3D Kulturen mechanisch oder enzymatisch, aber nicht auf die einzelne Zelle-Niveau.

Während der Isolation der 3D Enteroids/Colonoids variiert die optimale Schütteldrehzahl je nach Drehzahl Durchmesser eines bestimmten Shaker-Modells. Die Absicht ist nicht nur die Platte für eine effektive Mischung, aber auch zu vermeiden, spritzt der Zellsuspension auf dem Cover der Platte oder in benachbarten Vertiefungen agitieren. Inkubationszeiten von < 30 min können Ausbeute residual BMM klammerte sich an Zellen, die Anlage und die Bildung von einheitlichen Zelle Monoschichten wenn auf Einsätze verchromt behindern können. Umfangreiche Inkubation (≥ 1 h) erbringt deutlich verminderte Zellviabilität.

Das Ausmaß der Verreibung benötigt, um 3D Enteroids/Colonoids distanzieren kann mit Kolben Steifigkeit und Benutzer Geschicklichkeit variieren. Regelmäßige Überprüfung der gut Inhalte auf einem Phasenkontrast-Lichtmikroskop wird empfohlen, Fragment Gleichförmigkeit während Verreibung, mit einem Ziel von etwa 30 Zellen pro Fragment zu bestimmen. Anstelle oder neben Verreibung kann die Aussetzung mit Trypsin, kleinere einheitliche Fragmente zu erhalten kurz verdaut werden. Trypsin verdauen kann wünschenswert sein, wenn Monolagen einen Großteil der 3D-artige Strukturen unter eine ansonsten einzelne Epithelschicht enthalten. Dissoziation, einzelne Zellen ist jedoch nicht wünschenswert, da dies wesentlich Zellviabilität abnimmt. Einen Brunnen von Enteroids/Colonoids in einem 35 μL BMM Tröpfchen kultiviert wird in der Regel ausreichen, um 2-3 Einsätze zu füllen, aber dieser Faktor variiert je nach Anzahl und durchschnittliche Größe der Enteroids/Colonoids.

Colonoid Monolagen können ein beträchtliches Volumen des Mediums apikalen absorbieren, wie sie zu unterscheiden. Dies kann umgangen werden, indem zusätzliche DM auf der oberen einfügen-Kammer (150-200 μL), obwohl teilweise Austrocknen der oberen Kammer nicht erscheint, Monolage Lebensfähigkeit oder Funktion in nachgeschalteten Tests negativ. Nach ca. 4-5 Tagen der Differenzierung entwickeln Colonoid Monolagen extrazellulärem Schleim, der nach dem vorsichtig Absaugen von DM als dick/gallertartigen Material auf der Zelloberfläche sichtbar sein kann.

Für die EHEC-Interaktion mit der äußeren Schleimschicht verwenden wir routinemäßig die bakterielle Titer und Inkubation Frist im Protokoll. Einzigartige Bakterienstämme sollten jedoch zunächst in mehreren Konzentrationen und Inkubationszeiten zu bestimmen, die entsprechenden Parameter für die gewünschte Wirkung untersucht werden.

Während Schleim Fixierung wird Absaugen der apikalen Mediums wahrscheinlich die meisten der extrazellulären ungebunden Schleimschicht entfernen. Daher ist es wichtig, sorgfältig das Medium ausgießen. Wenn das Medium im Einsatz durch Oberflächenspannung beibehalten wird, verwenden Sie die Ecke eines gefalteten Labor Gewebes um die Oberflächenspannung zu brechen und Docht entfernt die meisten des Mediums. Nach Fixierung und Färbung kann die Schleimschicht unbeabsichtigt verdrängt oder abgeflacht bei der Montage ein Deckglas über dem Filter einfügen. Um Schleim-Höhe zu erhalten, setzen Sie den Filter auf einen Rückgang der Montage Medien und legen Sie sorgfältig das Deckglas auf den Filter. Nicht tippen Sie oder drücken Sie auf das Deckglas, wie dies die Schleimschicht deutlich reduzieren kann.

Um eine polarisierte Monolage von Zellen in 3D Culture zu bilden, ist es notwendig, das Zusammenspiel der basolateralen Membran Integrine des intestinalen epithelialen Zellen und Proteine der extrazellulären Matrix (ECM) zu reproduzieren. Laminin, Kollagen IV, Fibronektin und ein Array von Proteoglykanen dar der intestinale epitheliale ECM. 21 , 22 wir gegenüber menschlichen Zelle abgeleitet Laminin, Kollagen IV, Fibronektin und Murine abgeleitet BMM als Insert-Beschichtungen. Nur Kollagen IV die Bildung von stabilen und langfristig (bis zu 4 Wochen unterstützt) konfluierende Enteroid/Colonoid Monoschichten (Abbildungen 1-2). Kleine Flecken von Monolayer-Wachstum wurden auf jedem der anderen getesteten Matrizen erhalten, aber diese Regionen konnten sich zur Konfluenz Fortschritt. Einsatz von menschlichen Kollagen IV wie die ECM-Leihmutter eine Reihe von Vorteilen hat. BMM abgeleitet von Engelbreth-Holm-Schwarm (EHS) murinen Sarkom Zellen nicht menschlichen Ursprungs sind, während menschliche Kollagen IV im Handel erhältlich und in der Regel kostengünstiger ist. Darüber hinaus das BMM ist ein komplexes Gemisch von Proteinen mit inhärenten Variabilität und enthalten das Sarkom sezerniert Wachstumsfaktoren, die Genexpression beeinflussen. 23

Wechselwirkungen zwischen intestinalen Epithelzellen und die zugrunde liegenden ECM in intestinalen epithelialen Restitution ist noch nicht vollständig verstanden. Die Bedeutung von Kollagen IV, aber nicht Laminin, als eine Adhäsion Liganden für menschliche Colonocytes24 und Enhancer Darm Krypta Epithelzelle Rückgabe25 ist vorgeschlagen worden, mit Antikörpern gegen Kollagen IV, die Anlage verhindert . Epitheliale ausgedrückt β1-Integrin scheint für ECM Interaktion wichtig sein, wie ein Antikörper, der spezifisch für β1-Integrin deutlich Haftung des Colonocytes Typ IV Kollagen blockiert. 24 während Kollagen IV eine zuverlässige ECM bietet für Enteroid/Colonoid Monolage Bildung auf Einsätze, epithelialen Umgestaltung des ECM im Laufe der Zeit wurde nicht noch bewertet in diesem Modell, noch hat Sie den Einfluss von komplexer und definierten ECM-Mischungen aus Kollagen IV, Laminin und Fibronektin.

Menschliche Enteroids/Colonoids in monomolekularen Film Format (Abbildungen 1-4) ermöglichen Manipulationen und Probenahme, die umständlich oder unmöglich zu erreichen, mit 3D Matrix eingebettet Kulturen wäre. 3D Enteroids/Colonoids variieren in Größe, strukturelle Komplexität und luminalen Volumen und Mikroinjektion von Mikroben oder kleine Moleküle sind daher schwerlich genau quantitate. Darüber hinaus verhindern, dass im Gegensatz zu der Monolayer (Tabelle 1), 3D Kulturen Direktzugriff auf der luminalen und basolateralen Oberflächen, Ionen, Nährstoffe, Cytokinen oder sezernierten Faktoren im Zusammenhang mit physiologischen oder pathophysiologische Prozesse zu messen . Konfluenz (Abbildungen 1-2) ist eine der wichtigsten Eigenschaften der Enteroid/Colonoid Monolage für Gründung nicht nur die physiologischen Verläufe von Nährstoffen, Ionen, und andere Makromoleküle,16 , sondern auch die Schaffung der richtigen Barriere notwendig zwischen luminalen Mikrobiota und sterilen mesenchymalen/Immune Zellen besiedelt serosal Umgebungen. Diese Facetten sind wichtig für zukünftige Studien zu betrachten, die Enteroid/Colonoid Monolagen mit mesenchymalen, immun oder neuronalen Zelltypen Erstellung komplexer physiologische Modelle integrieren.

Bekannte Grenzen des hier beschriebenen Zelle Kultur einfügen Modells gehören mangelnde körperliche Kräfte wie flüssige Schubspannung und mechanische Dehnung/Kompression (Peristaltik) und kein anaeroben apikalen Umfeld normalerweise durch intestinale erlebt Epithelien in-vivo. Diese Elemente haben das Potenzial, mit raffinierter Microphysiological Plattformen,26 angesprochen werden, aber sie erfordern auch zusätzliche Kosten, Ausrüstung und Know-how zur Umsetzung. 3D und Monolayer-Kulturen sind auch ohne Interaktionen mit oder Beiträge aus den Darm Mikrobiom, stromale Zellpopulationen und das Immunsystem, es sei denn, diese Komponenten gezielt hinzugefügt werden.

Zukünftige Anwendungen der Enteroid/Colonoid Monolage auf Kollagen IV-beschichtete Zelle Kultur Einsätze umfassen andere Studien von pathogenen oder Kommensalen mikrobielle Wechselwirkungen, Barrierefunktion, Drogen- oder Nährstoff-Aufnahme, Toxizität, Stoffwechsel und funktional Verbesserung durch Kokultur mit zusätzlichen Darm Zelltypen katalysiert. Auswertungen können nicht nur in Epithelien von gesunden Spendern, sondern auch von Personen mit Genmutationen oder Darm-Erkrankungen, vorgenommen werden, sofern die in-vivo Phänotypen niedergelassen sind, in ex-Vivo Enteroid/Colonoid Kultur bewahrt werden.

Offenlegungen

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Diese Arbeit wurde von NIH-Stipendien P01 AI125181, K01 DK106323 (JGI) und K01 DK113043 (JFA) unterstützt. Wir danken James Kaper (University of Maryland, Baltimore, MD, USA) für die Bereitstellung von E. Coli Stamm HS und EHEC. Wir erkennen auch die integrierte Physiologie und Bildgebung Kerne von der Hopkins Conte verdauungsfördernde Krankheit Basic und translationale Forschung Core Center (P30 DK089502) und der Johns Hopkins Mass Spectrometry und Proteomics Core.

Materials

2-Amino-2-(hydroxymethyl)-1,3-propanediol Sigma T4661 Tris base, Component of lysis buffer
A-83-01 Tocris 2939 ALK4/5/7 inhibitor
Acetic acid, glacial Fisher Scientific A38
Advanced DMEM/F12 Life Technologies 12634-010 Component of growth medium
Alexa Fluor 488 phalloidin Life Technologies A12379 Fluorescent probe for F-actin
Antibiotic/antimycotic cocktail Invivogen ant-pm-2 Primocin (100x)
B27, 50x Life Technologies 17504-044 Component of growth medium
Cell culture inserts Corning 3470 Transwell, PET membrane, 0.4 μm pore, 24-well plate
CHIR 99021 Tocris 4423 GSK3β inhibitor
Click-iT Plus EdU Alexa Fluor 594 Imaging Kit Life Technologies C10639
Collagen IV, from human placenta Sigma C5533
Cultrex Organoid Harvesting Solution Trevigen 3700-100-01 Depolymerizes basement membrane matrix
Enterohemorrhagic Escherichia coli (EHEC) Kaper lab, University of Maryland
Epithelial voltohmmeter World Precision Instruments EVOM2
Epithelial voltohmmeter electrode World Precision Instruments STX3
Escherichia coli strain HS Kaper lab, University of Maryland
Ethanol, absolute Pharmco 111000200
FluorSave mounting medium Millipore 345789 For mounting insert membrane on microscope slide
GlutaMAX Life Technologies 35050-061 L-alanyl-L-glutamine dipeptide, 200 mM
HEK293T/Noggin-Fc cell line van den Brink lab, Tytgat Institute for Liver and Intestinal Research For production of Noggin conditioned medium
HEK293T/RSPO1-Fc-HA cell line Trevigen 3710-001-K For production of Rspondin-1 conditioned medium
HEPES, 1 M Life Technologies 15630-080 Component of growth medium
Heraeus Multifuge X1R Centrifuge Thermo Fisher Scientific 75004250
Hoechst 33342 Life Technologies H3570 Fluorescent nuclear dye
Human epidermal growth factor (EGF) R&D Systems 236-EG-01M Component of growth medium
IGEPAL CA-630 Sigma I8896 Component of lysis buffer
Inverted cell culture light microscope Olympus CKX51
LB broth EMD Millipore 1.10285.0500
L-WNT3A cell line ATCC CRL-2647 For production of Wnt3a conditioned medium
Matrigel, growth factor reduced Corning 356231 Basement membrane matrix for 3D culture
Mini cell scraper United BioSystems MCS-200
MUC2 antibody, mouse monoclonal Abcam ab11197 Use at 1:100 for immunostaining, 1:500 for immunoblotting
MUC2 shRNA lentiviral particles GE Dharmacon RHS4531 GIPZ lentiviral shRNA, ID: 4583
Orbital shaker Grant Instruments PSU-10i
Penicillin-streptomycin, 100x Life Technologies 15140-122 Component of growth medium
Phosphate buffered saline Corning 21-031
Probe sonicator with microtip Branson Ultrasonics 450
Protease inhibitor cocktail for mammalian cells Sigma P8340 Component of lysis buffer
SB 202190 Tocris 1264 p38 MAPK inhibitor
Sodium chloride Sigma S3014 Component of lysis buffer
Sodium dexoycholate Sigma D6750 Component of lysis buffer
Sodium dodecyl sulfate Sigma L3771 Component of lysis buffer
TrypLE Express, 1x Life Technologies 12605-010 Trypsin, for digesting enteroid/colonoid fragments
Vinculin antibody, rabbit monoclonal Abcam ab129002 Use at 1:1000 for immunoblotting
Water, tissue culture grade, sterile filtered Corning 25-055
Y-27632 Tocris 1254 RhoA/ROCK inhibitor
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Referenzen

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In, J. G., Foulke-Abel, J., Clarke, E., Kovbasnjuk, O. Human Colonoid Monolayers to Study Interactions Between Pathogens, Commensals, and Host Intestinal Epithelium. J. Vis. Exp. (146), e59357, doi:10.3791/59357 (2019).
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