Tomographie automatisée de cohérence optique 3D pour élucider la morphogénèse du biofilm sur de grandes échelles spatiales

Les biofilms sont une adaptation microbienne très réussie du mode de vie et ces communautés de micro-organismes associées à l’interphase et fermées par matrice dominent la vie microbienne dans les milieux naturels et industriels^1,2. Là, les biofilms forment des architectures complexes, telles que les banderoles allongées³, ondulations⁴ ou les bouchons en forme de champignon⁵ avec des conséquences importantes pour la croissance des biofilms, la stabilité structurelle et la résistance au stress⁶. Bien que beaucoup de choses sur la différenciation structurelle des biofilms aient été tirées des travaux sur les cultures mono-espèces cultivées dans des chambres à débit miniatures, la plupart des biofilms sont des communautés très complexes, y compris souvent des membres de tous les domaines de la vie⁶. Apprécier ces biofilms complexes comme des paysages microbiens⁷ et comprendre comment la structure et la fonction des biofilms interagissent dans des communautés complexes est donc à l’avant-garde de la recherche sur les biofilms.

Une compréhension mécaniste de la morphogénèse de biofilms complexes en réponse à des indices environnementaux nécessite des expériences soigneusement conçues en conjonction avec des observations spatialement et temporellement résolues de la structure physique du biofilm à travers les échelles⁸. Cependant, l’observation non destructive de la croissance des biofilms dans les systèmes expérimentaux a été sévèrement limitée par des contraintes logistiques telles que la nécessité de déplacer des échantillons (par exemple, au microscope) endommageant souvent la structure délicate du biofilm.

Le protocole présenté ici introduit un système entièrement automatisé basé sur la tomographie de cohérence optique (OCT), qui permet la surveillance in situ et non invasive de la morphogénèse du biofilm à l’échelle méso-métrique (portée mm). OCT est une technique d’imagerie émergente dans la recherche sur les biofilms avec des applications dans le traitement de l’eau et la recherche sur le biofouling, la médecine⁹ et l’écologie des cours d’eau¹⁰. Dans OCT, une source lumineuse à faible cohérence est divisée en un échantillon et un bras de référence; l’interférence de la lumière réfléchie et dispersée par le biofilm (bras d’échantillon) et la lumière du bras de référence est analysée. Une série de profils d’intensité axiale (A-scans) qui contient des informations structurelles résolues en profondeur est acquise et fusionnée en une analyse B (une section transversale). Une série de B-scans adjacents compose le dernier balayage de volume 3D¹⁰. OCT fournit une résolution optique latérale de l’ordre d’environ 10 m et est donc bien adapté pour étudier la différenciation structurale mésoscopique des biofilms^10,12. Pour une description plus détaillée de l’OCT, consultez Drexler et Fujimoto¹³et Fercher et ses collègues¹⁴. Bien que le champ de vision d’un seul tCO xy-scan atteigne jusqu’à des centaines de micromètres carrés, les modèles à plus grande échelle ne peuvent pas être quantifiés au moyen de l’OCT dans un seul balayage. En ce qui concerne les biofilms dans les habitats naturels tels que les cours d’eau et les rivières, cela limite actuellement notre capacité d’évaluer la morphogénèse du biofilm à des échelles correspondant au modèle physique et hydraulique de l’habitat.

Afin de dépasser ces limites spatiales et d’acquérir automatiquement des scans OCT, une sonde d’imagerie OCT de domaine spectral a été montée sur un système de positionnement à 3 axes. L’installation permet l’acquisition de plusieurs scans OCT dans un motif de mosaïque qui se chevauche (analyse de tuiles), réalisant efficacement l’imagerie tomographique des surfaces jusqu’à 100 cm². En outre, la haute précision de positionnement de ce système permet de surveiller de manière fiable la croissance et le développement des caractéristiques des biofilms dans des sites spécifiques au cours d’expériences à long terme. Le système est modulaire et les composants individuels (c.-à-d., dispositif de positionnement et OCT) de l’installation peuvent être utilisés comme solutions autonomes ou combinés avec souplesse. La figure 1 donne un aperçu des composants durs et logiciels de l’installation.

Le système a été testé avec un dispositif de positionnement CNC contrôlé par GRBL (Tableaudes matériaux). Les distances de fonctionnement de cette plate-forme de positionnement spécifique sont de 600 à 840 x 140 mm, avec une précision indiquée par le fabricant de 0,05 mm et une résolution programmable de 0,005 mm. GRBL est un open-source (licence GPLv3), un contrôle de mouvement haute performance pour CNC Dispositifs. Par conséquent, chaque appareil de positionnement basé sur GRBL (version ‘1.1) doit être compatible avec les lignes directrices et les progiciels présentés ici. En outre, le logiciel pourrait être adapté à d’autres contrôleurs stepmotor avec le type d’entrée STEP-DIR avec peu de modifications.

Le dispositif OCT utilisé pour évaluer les performances du système (Tableau des matériaux) dispose d’une source lumineuse à faible cohérence avec une longueur d’onde centrale de 930 nm (bande passante de 160 nm) et une longueur et une intensité de référence réglables. Dans l’exemple présenté ici, un adaptateur d’immersion pour plonger la sonde OCT dans l’eau qui coule a également été utilisé (Tableau des matériaux). Le logiciel développé ici pour l’acquisition automatisée de balayage OCT dépend de façon critique de la SDK fourni avec le système OCT spécifique, cependant, les systèmes OCT du même fabricant avec différentes lentilles d’analyse et longueurs d’onde centrales devraient être facilement compatibles.

L’appareil GRBL est contrôlé par un serveur web installé sur un ordinateur à seule carte (Figure 1). Cela permet de contrôler à distance l’appareil à partir de n’importe quel ordinateur avec un réseau local ou un accès à Internet. L’appareil OCT est contrôlé par un ordinateur séparé, permettant le fonctionnement du système OCT en dehors de la configuration expérimentale automatisée. Enfin, les progiciels comprennent des bibliothèques pour synchroniser le positionnement de la sonde OCT et l’acquisition d’un scan OCT (c.-à-d. pour acquérir automatiquement des ensembles de données d’imagerie 3D dans un modèle de mosaïque ou dans un ensemble de positions définies). Définir la position de la sonde OCT en 3D permet d’ajuster efficacement le plan focal spécifiquement pour les scans (régionaux). Plus précisément, sur des surfaces inégales, différents plans focaux (c.-à-d. différentes positions dans la direction z) peuvent être spécifiés pour chaque analyse OCT.

Un ensemble de progiciels a été développé pour traiter les scans D’OCT bruts (tableau1). La navigation du dispositif de positionnement, l’acquisition d’analyse OCT et le traitement des ensembles de données sont effectués avec des ordinateurs portables Jupyter codés python, ce qui permet une flexibilité remarquable dans le développement et l’optimisation du logiciel. Deux exemples travaillés et annotés de ces ordinateurs portables (pour l’acquisition et le traitement d’images, respectivement) sont disponibles à partir de https://gitlab.com/FlumeAutomation/automated-oct-scans-acquisition.git Ils sont destinés comme points de départ pour la personnalisation de la méthode. Un ordinateur portable Jupyter est une application basée sur le navigateur Web qui contient des cellules avec du code Python annoté. Chaque étape est contenue dans une cellule du carnet, qui peut être exécutée séparément. En raison de la longueur différente du chemin de lumière à travers la lentille de balayage (aberration sphérique)¹⁵, les scans BRUTs OCT semblent déformés (Figure 2A). Nous avons développé un algorithme pour corriger automatiquement cette distorsion dans les scans OCT acquis (contenu dans ImageProcessing.ipynb, Dossier supplémentaire 1). En outre, la morphologie des biofilms peut être visualisée comme une carte d’élévation 2D, comme cela a été utilisé précédemment dans les systèmes membranaires¹⁶, et nous illustrons comment les cartes d’altitude obtenues à partir de scans effectués dans un tableau de carrelage peuvent être cousues.

Enfin, la fonctionnalité de l’installation de laboratoire décrite est illustrée à l’aide d’une expérience de flume dans laquelle le biofilm de flux phototrophique est exposé à un gradient de vitesse d’écoulement.