DNA Elektroforez tiyazol turuncu etidyum bromür veya alternatif boya yerine kullanma
Summary
Burada, DNA tespiti Jel Elektroforez deneylerde tiyazol turuncu kullanılacak iletişim kuralı mevcut. Etidyum bromür ortadan kaldırılması tiyazol turuncu kullanılmasına ve floresan algılama UV ya da mavi ışık ile elde edilebilir.
Abstract
Özel kullanarak DNA Jel Elektroforez Moleküler Biyoloji Laboratuvarları, boyutuna göre DNA parçalarının ayrılması sağlayan ortak bir araç olduğunu. Ayrılıktan sonra DNA boyama tarafından görüntülenmiştir. Bu makalede tiyazol leke turuncu DNA kullanımı gösterilmiştir. Hassas, ucuz, UV veya (örnek zarar önlemek için) mavi ışık ile heyecanlı ve etidyum bromür daha güvenli olduğu tiyazol turuncu olumlu ortak boyama yöntemleri karşılaştırır. Zaten DNA Elektroforez deneyler etidyum bromür kullanarak çalıştırmak için donatılmış laboratuvarları genellikle boyalar ile herhangi bir ek değişiklik algılama için UV ışık kullanarak varolan iletişim kuralları, geçiş yapabilirsiniz. Mavi ışık algılama örnek zarar görmemesi için Ayrıca bir mavi ışık kaynağı ve emisyon filtre ile elde edilebilir. Zaten mavi ışık algılama için donatılmış labs sadece boya ile herhangi bir ek değişiklik varolan iletişim kuralları için geçiş yapabilirsiniz.
Introduction
Bu yöntemin amacı DNA Floresans algılama için tiyazol turuncu (için) kullanarak özel jelleri belirlemektir. Onun alçak fiyat ve olumlu Emanet profil nedeniyle tiyazol turuncu lisans öğretim labs ve moleküler biyoloji, özellikle d ve klonlama performans araştırma laboratuvarları belirli fayda görebilirsiniz.
Etidyum bromür DNA tespiti özel jelleri içinde en yaygın boya kalır. Bu öncelikle çok ucuz elde edilebilir çünkü ve sadece algılama için uyarma UV ışığıyla gerektirir. Her iki etidyum bromür ve tiyazol turuncu ucuz, düşük algılama sınırları (1-2 ng/lane)1. Üzerine tiyazol turuncu artıran iki ana dezavantajları vardır etidyum bromür, ancak.
İlk olarak, tiyazol turuncu daha az mutajenik ise etidyum bromür özel işlem, nakliye ve bertaraf gereksinimleri, alkil2 ‘ dir (3-4 x daha az Ames testi mutajenik)3,4 ve genellikle ile bertaraf ortak kimyasal atık.
İkinci olarak, etidyum bromür algılama için UV ışık gerektirir. Tiyazol turuncu UV ışığı istenirse benzer şekilde kullanabilirsiniz, ancak aynı zamanda mavi ışık ile tespit edilebilir. UV ışığı, yaygın olarak kullanılan, birkaç belirgin dezavantajları vardır. İlk olarak, insan cilt ve göz zarar veriyor. UV ışık eğitimli profesyoneller tarafından güvenle kullanılabilir ise, kaza sonucu deri ya da göz zararlardan (işlevsel olarak sunburns için benzer) laboratuvar UV ışık özellikle deneyimsiz bilim adamları ile nadir değildir. İkinci olarak, UV ışık son derece aşağı akım deneyler (örneğin ligasyonu ve dönüştürme)1,6,7başarısını azaltan DNA örnekleri5‘ e, zarar veriyor. Kime mavi ışık ile algılama sağlar (λeski, max 510 = nm (488 nm ve 470 nm da göstermek güçlü uyarma)), hangi Deri Hasari neden olmaz veya DNA hasar (herhangi bir yoğun ışık hala gözlere zararlı olabilir, ancak), her iki bilim adamı riskleri büyük ölçüde azalan ve örnek.
Etidyum bromür sadece floresan boya alternatif için değil; onun avantajı maliyetidir. İÇİN Retikülosit leke8olarak 1980’lerde keşfedildi ve yardımcı programı Floresans DNA tabanlı deneyler9,10,11,12,13bir dizi içinde buldu. Şu anda birden çok tedarikçi tarafından satılmaktadır. Etmektir üst bileşik ek, daha pahalı, mavi-ışık-detectable ticari boya ve Elektroforez, UV veya mavi ışık için algılama1kullanarak sırasında benzer şekilde davranır. Ayrıca, diğer boyalar genel Elektroforez deneyleri için EtBr ya da kime, çok düşük DNA konsantrasyonları daha duyarlı olmakla birlikte, bu tür boyalar çok bağlamlarda çok pahalı.
Protocol
Representative Results
Discussion
Etidyum bromür uzun moleküler biyoloji laboratuarında bilinen toksisite rağmen standart bir araç olmuştur. Bu da tespit edilmeden gibi DNA zarar UV ışık gerektirmelerini yaşanıyor. Tiyazol turuncu etidyum bromür, aynı zamanda yararlı ama pahalı ticari boyalar için ucuz bir alternatif sunmaktadır.
Tiyazol turuncu faydaları böylece iki kat vardır. İlk olarak, tiyazol turuncu sadece etidyum bromür için bir yedek olarak kullanılabilir. Jelleri aynı şekilde leke (Adım 1.2…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu eser Christopher Newport Üniversitesi’nden TDG için başlangıç fonlar tarafından desteklenmiştir.
Materials
| 2-log DNA ladder | New England Biolabs | N0469S | |
| Agarose (Genetic Analysis Grade) | Fisher | BP1356-100 | |
| Blue-light flashlight | WAYLLSHINE (Amazon) | WAYLLSHINE Scalable Blue LED | |
| ChemiDoc MP | Biorad | 1708280 | |
| DMSO | Sigma-Aldrich | D8418 | |
| ethidium bromide | Fisher | BP1302-10 | For comparison, not necessary for protocol |
| Gel apparatus (Owl Easy Cast) | Thermo Scientific | B1A | |
| Qiagen Qiaquick Gel extraction kit | Qiagen | 28704 | |
| Safe Imager Viewing Glasses | Invitrogen | S37103 | Necessary for using blue light flashlight.* |
| SafeImager 2.0 (Blue light transilluminator) | Invitrogen | G6600 | Blue light flashlight may be used as alternative |
| SYBR Safe | Invitrogen | S33102 | For comparison, not necessary for protocol |
| TAE (Tris-Acetate-EDTA) | Corning | 46-010-CM | |
| Thiazole orange | Sigma-Aldrich | 390062 | |
| *Glasses are also included with Invitrogen G6600 |
Referenzen
- O’Neil, C. S., Beach, J. L., Gruber, T. D. Thiazole orange as an everyday replacement for ethidium bromide and costly DNA dyes for electrophoresis. Electrophoresis. 39 (12), 1474-1477 (2018).
- McCann, J., Choi, E., Yamasaki, E., Ames, B. N. Detection of carcinogens as mutagens in the Salmonella/microsome test: assay of 300 chemicals. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 72 (12), 5135-5139 (1975).
- Evenson, W. E., Boden, L. M., Muzikar, K. A., O’Leary, D. J. 1H and 13C NMR Assignments for the Cyanine Dyes SYBR Safe and Thiazole Orange. The Journal of Organic Chemistry. 77 (23), 10967-10971 (2012).
- Beaudet, M., Cox, G., Yue, S. . Molecular Probes, Inc. , (2005).
- Pfeifer, G. P., You, Y. H., Besaratinia, A. Mutations induced by ultraviolet light. Mutation Research. 571 (1-2), 19-31 (2005).
- Cariello, N. F., Keohavong, P., Sanderson, B. J., Thilly, W. G. DNA damage produced by ethidium bromide staining and exposure to ultraviolet light. Nucleic Acids Research. 16 (9), 4157 (1988).
- Hartman, P. S. Transillumination can profoundly reduce transformation frequencies. BioTechniques. 11 (6), 747-748 (1991).
- Lee, L. G., Chen, C. H., Chiu, L. A. Thiazole orange: a new dye for reticulocyte analysis. Cytometry. 7 (6), 508-517 (1986).
- Nygren, J., Svanvik, N., Kubista, M. The Interactions Between the Fluorescent Dye Thiazole Orange and DNA. Biopolymers. , 1-13 (1998).
- Svanvik, N., Westman, G., Wang, D., Kubista, M. Light-Up Probes: Thiazole Orange-Conjugated Peptide Nucleic Acid for Detection of Target Nucleic Acid in Homogeneous Solution. Analytical Biochemistry. 281 (1), 26-35 (2000).
- Yang, P., De Cian, A., Teulade-Fichou, M. P., Mergny, J. L., Monchaud, D. Engineering Bisquinolinium/Thiazole Orange Conjugates for Fluorescent Sensing of G-Quadruplex DNA. Angewandte Chemie International Edition. 48 (12), 2188-2191 (2009).
- Fang, G. M., Chamiolo, J., Kankowski, S., Hovelmann, F., Friedrich, D., Lower, A., Meier, J. C., Seitz, O. A bright FIT-PNA hybridization probe for the hybridization state specific analysis of a C → U RNA edit via FRET in a binary system. Chemical Science. 9 (21), 4794-4800 (2018).
- Pei, R., Rothman, J., Xie, Y., Stojanovic, M. N. Light-up properties of complexes between thiazole orange-small molecule conjugates and aptamers. Nucleic Acids Research. 37 (8), e59-e59 (2009).
- Lee, P. Y., Costumbrado, J., Hsu, C. Y., Kim, Y. H. Agarose Gel Electrophoresis for the Separation of DNA Fragments. Journal of Visualized Experiments. (62), 1-5 (2012).
- Vogelstein, B., Gillespie, D. Preparative and analytical purification of DNA from agarose. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 76 (2), 615-619 (1979).
