Electroforesis de DNA utilizando naranja de tiazol en lugar de bromuro de etidio o tintes alternativos
Summary
Aquí, presentamos un protocolo para utilizar tiazol naranja para la detección de ADN en experimentos de electroforesis de gel. El uso de naranja de tiazol permite eliminación de bromuro de etidio, y se logra la detección de la fluorescencia con luz azul o UV.
Abstract
Electroforesis en gel de DNA utilizando agarosa es una herramienta común en laboratorios de biología molecular, permitiendo la separación de fragmentos de ADN por tamaño. Después de la separación, ADN es visualizado por la coloración. Este artículo muestra cómo utilizar tiazol naranja para teñir ADN. Naranja de tiazol compara favorablemente a los métodos de tinción común, que es sensible, barato, excitable con UV o luz azul (para evitar el daño de la muestra) y más seguro que el bromuro de etidio. Laboratorios equipados ya para ejecutar experimentos de electroforesis de ADN con bromuro de etidio pueden cambiar generalmente tintes sin cambios adicionales a los protocolos existentes, utilizando luz ultravioleta para la detección. Además, detección de luz azul para evitar el daño de la muestra se logra con un filtro de la fuente y emisión de luz azul. Laboratorios ya equipados para la detección de luz azul pueden cambiar simplemente tintes sin cambios adicionales a los protocolos existentes.
Introduction
El propósito de este método es identificar ADN en geles de agarosa utilizando tiazol naranja (a) para la detección de fluorescencia. Debido a su perfil de seguridad favorable y bajo costo, naranja de tiazol puede ver beneficio particular en los laboratorios de docencia de pregrado y laboratorios de investigación realizar biología molecular, especialmente trompas y clonación.
Bromuro de etidio queda el tinte más común para la detección de ADN en geles de agarosa. Esto es principalmente porque se puede obtener muy poco costosa y sólo requiere excitación con luz UV para la detección. Ambos etidio bromuro y tiazol naranja son baratos, con baja detección de límites (1-2 ng/carril)1. Hay dos principales inconvenientes a bromuro de etidio naranja de tiazol mejora.
En primer lugar, bromuro de etidio es un mutágeno2 especiales de manejo, envío y requisitos de la disposición, mientras que el naranja de tiazol es menos mutagénico (3 – 4 x menos mutagénicos en la prueba de Ames)3,4 y pueden eliminarse generalmente de con residuos químicos comunes.
En segundo lugar, bromuro de etidio requiere luz UV para la detección. Naranja de tiazol semejantemente puede usar luz UV si se desea, pero también puede ser detectada con luz azul. Luz UV, mientras que comúnmente utilizado, tiene algunas desventajas salientes. En primer lugar, es dañino a los ojos y la piel humana. Mientras que la luz UV puede ser utilizada con seguridad por profesionales capacitados, piel o los ojos daños accidentales (funcionalmente similar a las quemaduras de sol) de la luz UV de laboratorio no son infrecuentes particularmente con científicos inexpertos. En segundo lugar, la luz UV es extremadamente perjudicial para el DNA muestras5, que reduce el éxito de posteriores experimentos (como la ligadura y transformación)1,6,7. A permite la detección con luz azul (λex, max = 510 nm (488 nm y 470 nm también muestran excitación fuerte)), que no causa daño a la piel o daño de ADN (aunque cualquier luz intensa todavía puede ser dañoso a los ojos), disminuyendo enormemente los riesgos para ambos el científico y la muestra.
No es la alternativa de colorante fluorescente sólo a bromuro de etidio; su ventaja es el costo. A fue descubierto en la década de 1980 como una mancha de reticulocitos8y ha encontrado utilidad en un número de fluorescencia basada en ADN experimentos9,10,11,12,13. Actualmente se vende por varios proveedores. A es el compuesto original de adicional, más caro, azul-luz – detectable tintes comerciales y se comporta de manera similar durante la electroforesis, utilizando luz azul o UV para detección1. Además, mientras que otros tintes son más sensibles a concentraciones muy bajas de ADN que EtBr o a, para los experimentos de electroforesis genérico, estos tintes son prohibitivos en muchos contextos.
Protocol
Representative Results
Discussion
Bromuro de etidio durante mucho tiempo ha sido una herramienta estándar en el laboratorio de biología molecular, a pesar de toxicidad conocido. Padece también requieren luz ultravioleta, que daña el ADN que se está detectando. Thiazole orange ofrece una alternativa económica a bromuro de etidio, así como tintes comerciales útiles pero costosos.
Los beneficios de la naranja de tiazol son así dos veces. En primer lugar, naranja de tiazol simplemente puede utilizarse como sustitución de…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabajo fue apoyado por fondos de arranque a TDG de Christopher Newport University.
Materials
| 2-log DNA ladder | New England Biolabs | N0469S | |
| Agarose (Genetic Analysis Grade) | Fisher | BP1356-100 | |
| Blue-light flashlight | WAYLLSHINE (Amazon) | WAYLLSHINE Scalable Blue LED | |
| ChemiDoc MP | Biorad | 1708280 | |
| DMSO | Sigma-Aldrich | D8418 | |
| ethidium bromide | Fisher | BP1302-10 | For comparison, not necessary for protocol |
| Gel apparatus (Owl Easy Cast) | Thermo Scientific | B1A | |
| Qiagen Qiaquick Gel extraction kit | Qiagen | 28704 | |
| Safe Imager Viewing Glasses | Invitrogen | S37103 | Necessary for using blue light flashlight.* |
| SafeImager 2.0 (Blue light transilluminator) | Invitrogen | G6600 | Blue light flashlight may be used as alternative |
| SYBR Safe | Invitrogen | S33102 | For comparison, not necessary for protocol |
| TAE (Tris-Acetate-EDTA) | Corning | 46-010-CM | |
| Thiazole orange | Sigma-Aldrich | 390062 | |
| *Glasses are also included with Invitrogen G6600 |
Referenzen
- O’Neil, C. S., Beach, J. L., Gruber, T. D. Thiazole orange as an everyday replacement for ethidium bromide and costly DNA dyes for electrophoresis. Electrophoresis. 39 (12), 1474-1477 (2018).
- McCann, J., Choi, E., Yamasaki, E., Ames, B. N. Detection of carcinogens as mutagens in the Salmonella/microsome test: assay of 300 chemicals. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 72 (12), 5135-5139 (1975).
- Evenson, W. E., Boden, L. M., Muzikar, K. A., O’Leary, D. J. 1H and 13C NMR Assignments for the Cyanine Dyes SYBR Safe and Thiazole Orange. The Journal of Organic Chemistry. 77 (23), 10967-10971 (2012).
- Beaudet, M., Cox, G., Yue, S. . Molecular Probes, Inc. , (2005).
- Pfeifer, G. P., You, Y. H., Besaratinia, A. Mutations induced by ultraviolet light. Mutation Research. 571 (1-2), 19-31 (2005).
- Cariello, N. F., Keohavong, P., Sanderson, B. J., Thilly, W. G. DNA damage produced by ethidium bromide staining and exposure to ultraviolet light. Nucleic Acids Research. 16 (9), 4157 (1988).
- Hartman, P. S. Transillumination can profoundly reduce transformation frequencies. BioTechniques. 11 (6), 747-748 (1991).
- Lee, L. G., Chen, C. H., Chiu, L. A. Thiazole orange: a new dye for reticulocyte analysis. Cytometry. 7 (6), 508-517 (1986).
- Nygren, J., Svanvik, N., Kubista, M. The Interactions Between the Fluorescent Dye Thiazole Orange and DNA. Biopolymers. , 1-13 (1998).
- Svanvik, N., Westman, G., Wang, D., Kubista, M. Light-Up Probes: Thiazole Orange-Conjugated Peptide Nucleic Acid for Detection of Target Nucleic Acid in Homogeneous Solution. Analytical Biochemistry. 281 (1), 26-35 (2000).
- Yang, P., De Cian, A., Teulade-Fichou, M. P., Mergny, J. L., Monchaud, D. Engineering Bisquinolinium/Thiazole Orange Conjugates for Fluorescent Sensing of G-Quadruplex DNA. Angewandte Chemie International Edition. 48 (12), 2188-2191 (2009).
- Fang, G. M., Chamiolo, J., Kankowski, S., Hovelmann, F., Friedrich, D., Lower, A., Meier, J. C., Seitz, O. A bright FIT-PNA hybridization probe for the hybridization state specific analysis of a C → U RNA edit via FRET in a binary system. Chemical Science. 9 (21), 4794-4800 (2018).
- Pei, R., Rothman, J., Xie, Y., Stojanovic, M. N. Light-up properties of complexes between thiazole orange-small molecule conjugates and aptamers. Nucleic Acids Research. 37 (8), e59-e59 (2009).
- Lee, P. Y., Costumbrado, J., Hsu, C. Y., Kim, Y. H. Agarose Gel Electrophoresis for the Separation of DNA Fragments. Journal of Visualized Experiments. (62), 1-5 (2012).
- Vogelstein, B., Gillespie, D. Preparative and analytical purification of DNA from agarose. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 76 (2), 615-619 (1979).
