Электрофорез ДНК, вместо тиазол оранжевый бромид Ethidium или альтернативных красители
Summary
Здесь мы представляем протокол тиазол оранжевый для обнаружения ДНК в экспериментах электрофореза геля. Использование тиазол оранжевый позволяет ликвидации бромид ethidium, и флуоресценции обнаружения может быть достигнуто с УФ или синий свет.
Abstract
Электрофорез геля дна агарозы с помощью является общим инструментом в лаборатории молекулярной биологии, позволяя разделения фрагментов ДНК по размеру. После разделения ДНК является визуализированы пятнать. Эта статья демонстрирует использование тиазол оранжевые пятна ДНК. Тиазол оранжевый выгодно общих пятная методов, в том, что чувствительные, недорогой, возбудимых с УФ или синий свет (во избежание повреждения образца) и безопаснее, чем бромид ethidium. Лаборатории, уже оснащены для запуска ДНК электрофорез эксперименты с использованием бромид ethidium обычно можно переключиться существующих протоколов, с помощью ультрафиолетовый свет для обнаружения красителей без дополнительных изменений. Синий свет обнаружения повреждения образца дополнительно может быть достигнуто с фильтром источника и выбросов синий свет. Лаборатории, уже оборудованные для обнаружения синий свет можно просто переключиться красителей без дополнительных изменений к существующим протоколам.
Introduction
Этот метод предназначен для выявления ДНК в гелях агарозы, используя тиазол оранжевый (для) для флуоресценции обнаружения. Из-за его низкой стоимости и благоприятные безопасности профиля тиазола оранжевый может увидеть особую пользу в Бакалавриат учебных лабораторий и исследовательских лабораторий, выполняющих молекулярной биологии, особенно перешнуровок и клонирования.
Бромид ethidium остается наиболее распространенных краситель для обнаружения ДНК в гелях агарозы. Это главным образом потому, что она может быть получена весьма недорого и только требует возбуждения с ультрафиолетовый свет для обнаружения. Обе ethidium бромид и тиазол оранжевый недорогой, с низкой обнаружения пределов (1-2 нг/пер)1. Есть два главных недостатка бромид ethidium, однако, которые тиазол оранжевый улучшает.
Во-первых, бромид ethidium является мутагенным2 с специальной обработки, доставки и удаления требования, тогда как тиазол оранжевый менее мутагенные (3 – 4 x менее мутагенному Эймс теста)3,4 и может быть вообще утилизировать вместе с общие химические отходы.
Во-вторых бромид ethidium требует ультрафиолетовый свет для обнаружения. Тиазол оранжевый при желании также можно использовать УФ-излучения, но также могут быть обнаружены с синим светом. Ультрафиолетовый свет, в то время как широко используется, имеет несколько характерных недостатков. Во-первых это ущерб человеческой кожи и глаз. В то время как ультрафиолета может безопасно использоваться обученными профессионалами, кожи или глаз случайных (функционально похож на солнечных ожогов) от Лаборатория УФ света не являются редкостью особенно с неопытными учеными. Во-вторых ультрафиолета чрезвычайно повреждения ДНК образцов5, что снижает успех течению экспериментов (например, перевязки и трансформации)1,6,7. В позволяет обнаруживать с голубой свет (λex, Макс = 510 Нм (488 нм и 470 Нм также показывают сильного возбуждения)), которая не вызывает повреждения кожи или ДНК повреждения (хотя любой интенсивный свет все еще могут быть вредны для глаз), значительно снижается риск как ученый и образец.
Является не только Люминесцентную краску альтернативой бромид ethidium; его преимуществом является стоимость. ЧТОБЫ был обнаружен в 1980-х как пятно ретикулоцитов8и утилита в ряде на основе ДНК флуоресценции эксперименты9,10,11,12,13. В настоящее время он продается с несколькими поставщиками. Это родительский комплекса дополнительных, более дорогие, синий свет – необнаруживаемых коммерческих красители и ведет себя аналогично во время электрофореза, используя УФ или синий свет для обнаружения1. Кроме того в то время как другие красители более чувствительны к очень низкой концентрации ДНК чем бромистый этидий или к, для универсального электрофорез эксперименты, такие красители являются дорогими во многих контекстах.
Protocol
Representative Results
Discussion
Бромид ethidium уже давно стандартным инструментом в лаборатории молекулярной биологии, несмотря на известные токсичности. Он также страдает от требующих УФ света, который повреждает ДНК, как он определяется. Тиазол orange предлагает недорогой альтернативой бромид ethidium, а также полезные, но ?…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа была поддержана запуска средства для пог от Университет Кристофера Ньюпорта.
Materials
| 2-log DNA ladder | New England Biolabs | N0469S | |
| Agarose (Genetic Analysis Grade) | Fisher | BP1356-100 | |
| Blue-light flashlight | WAYLLSHINE (Amazon) | WAYLLSHINE Scalable Blue LED | |
| ChemiDoc MP | Biorad | 1708280 | |
| DMSO | Sigma-Aldrich | D8418 | |
| ethidium bromide | Fisher | BP1302-10 | For comparison, not necessary for protocol |
| Gel apparatus (Owl Easy Cast) | Thermo Scientific | B1A | |
| Qiagen Qiaquick Gel extraction kit | Qiagen | 28704 | |
| Safe Imager Viewing Glasses | Invitrogen | S37103 | Necessary for using blue light flashlight.* |
| SafeImager 2.0 (Blue light transilluminator) | Invitrogen | G6600 | Blue light flashlight may be used as alternative |
| SYBR Safe | Invitrogen | S33102 | For comparison, not necessary for protocol |
| TAE (Tris-Acetate-EDTA) | Corning | 46-010-CM | |
| Thiazole orange | Sigma-Aldrich | 390062 | |
| *Glasses are also included with Invitrogen G6600 |
Referenzen
- O’Neil, C. S., Beach, J. L., Gruber, T. D. Thiazole orange as an everyday replacement for ethidium bromide and costly DNA dyes for electrophoresis. Electrophoresis. 39 (12), 1474-1477 (2018).
- McCann, J., Choi, E., Yamasaki, E., Ames, B. N. Detection of carcinogens as mutagens in the Salmonella/microsome test: assay of 300 chemicals. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 72 (12), 5135-5139 (1975).
- Evenson, W. E., Boden, L. M., Muzikar, K. A., O’Leary, D. J. 1H and 13C NMR Assignments for the Cyanine Dyes SYBR Safe and Thiazole Orange. The Journal of Organic Chemistry. 77 (23), 10967-10971 (2012).
- Beaudet, M., Cox, G., Yue, S. . Molecular Probes, Inc. , (2005).
- Pfeifer, G. P., You, Y. H., Besaratinia, A. Mutations induced by ultraviolet light. Mutation Research. 571 (1-2), 19-31 (2005).
- Cariello, N. F., Keohavong, P., Sanderson, B. J., Thilly, W. G. DNA damage produced by ethidium bromide staining and exposure to ultraviolet light. Nucleic Acids Research. 16 (9), 4157 (1988).
- Hartman, P. S. Transillumination can profoundly reduce transformation frequencies. BioTechniques. 11 (6), 747-748 (1991).
- Lee, L. G., Chen, C. H., Chiu, L. A. Thiazole orange: a new dye for reticulocyte analysis. Cytometry. 7 (6), 508-517 (1986).
- Nygren, J., Svanvik, N., Kubista, M. The Interactions Between the Fluorescent Dye Thiazole Orange and DNA. Biopolymers. , 1-13 (1998).
- Svanvik, N., Westman, G., Wang, D., Kubista, M. Light-Up Probes: Thiazole Orange-Conjugated Peptide Nucleic Acid for Detection of Target Nucleic Acid in Homogeneous Solution. Analytical Biochemistry. 281 (1), 26-35 (2000).
- Yang, P., De Cian, A., Teulade-Fichou, M. P., Mergny, J. L., Monchaud, D. Engineering Bisquinolinium/Thiazole Orange Conjugates for Fluorescent Sensing of G-Quadruplex DNA. Angewandte Chemie International Edition. 48 (12), 2188-2191 (2009).
- Fang, G. M., Chamiolo, J., Kankowski, S., Hovelmann, F., Friedrich, D., Lower, A., Meier, J. C., Seitz, O. A bright FIT-PNA hybridization probe for the hybridization state specific analysis of a C → U RNA edit via FRET in a binary system. Chemical Science. 9 (21), 4794-4800 (2018).
- Pei, R., Rothman, J., Xie, Y., Stojanovic, M. N. Light-up properties of complexes between thiazole orange-small molecule conjugates and aptamers. Nucleic Acids Research. 37 (8), e59-e59 (2009).
- Lee, P. Y., Costumbrado, J., Hsu, C. Y., Kim, Y. H. Agarose Gel Electrophoresis for the Separation of DNA Fragments. Journal of Visualized Experiments. (62), 1-5 (2012).
- Vogelstein, B., Gillespie, D. Preparative and analytical purification of DNA from agarose. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 76 (2), 615-619 (1979).
