Eletroforese de DNA usando tiazol laranja em vez de brometo de etídio ou corantes alternativos
Summary
Aqui, apresentamos um protocolo para usar tiazol laranja para a detecção de DNA em experimentos de electroforese do gel. O uso de laranja tiazol permite a eliminação do brometo de etídio, e detecção de fluorescência pode ser obtida com UV ou luz azul.
Abstract
Eletroforese em gel de DNA usando agarose é uma ferramenta comum em laboratórios de biologia molecular, que permite a separação de fragmentos de DNA de tamanho. Após a separação, o DNA é visualizado pela coloração. Este artigo demonstra como usar o DNA de tiazol laranja para manchar. Laranja de tiazol compara-se favoravelmente a métodos comuns de coloração, em que é sensível, barata, excitáveis com UV ou luz azul (para não danificar a amostra) e mais seguro do que o brometo de etídio. Laboratórios já equipados para executar experiências de electroforese de DNA utilizando o brometo de etídio geralmente podem alternar corantes sem alterações adicionais aos protocolos existentes, usando luz UV para a deteção. Deteção de luz azul para evitar dano da amostra além disso pode ser alcançada com um filtro de fonte e de emissão de luz azul. Laboratórios já equipados para a deteção de luz azul podem simplesmente alternar corantes sem alterações adicionais aos protocolos existentes.
Introduction
A finalidade desse método é identificar o DNA em gel de agarose usando tiazol laranja (a) para a deteção de fluorescência. Devido a seu perfil de segurança de baixo custo e favorável, laranja tiazol pode ver benefício particular em laboratórios de ensino de graduação e laboratórios de pesquisa, realizando a biologia molecular, especialmente a ligadura e a clonagem.
Brometo de etídio permanece o corante mais comum para detecção de DNA em gel de agarose. Isto é principalmente porque pode ser obtido muito barata e requer apenas excitação com luz UV para a deteção. Ambas as ethidium brometo e tiazol laranja são baratos, com deteção de baixos limites (1-2 ng/pista)1. Existem duas desvantagens principais de brometo de etídio, no entanto, que laranja tiazol melhora.
Primeiro, brometo de etídio é um agente mutagénico2 com tratamento especial, transporte e eliminação requisitos, Considerando que laranja tiazol é menos mutagênico (3 – 4 x menos mutagênico no teste de Ames)3,4 e pode ser descartado em geral com resíduos químicos comuns.
Em segundo lugar, o brometo de ethidium requer luz UV para a deteção. Laranja de tiazol similarmente pode usar luz UV, se desejado, mas também pode ser detectada com luz azul. Luz UV, embora comumente utilizadas, tem algumas desvantagens importantes. Em primeiro lugar, é prejudicial para os olhos e a pele humana. Enquanto a luz UV pode ser usada com segurança por profissionais treinados, a pele ou os olhos danos acidentais (funcionalmente semelhante a queimaduras) da luz UV de laboratório não são incomuns particularmente com cientistas inexperientes. Em segundo lugar, a luz UV é extremamente prejudicial para DNA amostras5, que reduz o sucesso de experiências a jusante (tais como ligadura e transformação)1,6,7. TO permite a detecção com luz azul (λex, máximo = 510 nm (488 nm e 470 nm também mostrar forte excitação)), que não causa danos à pele ou danificar o DNA (embora qualquer luz intensa ainda pode ser prejudicial para os olhos), diminuindo significativamente os riscos para ambos o cientista e a amostra.
Não é a alternativa de tintura fluorescente só de brometo de etídio; sua vantagem é o custo. QUE foi descoberto na década de 1980 como uma mancha de Reticulócito8e encontrou o utilitário em um número de fluorescência baseado em DNA experiências9,10,11,12,13. Atualmente é vendida por vários fornecedores. QUE é o composto de adicional, mais caro, azul-luz – detectável corantes comerciais e se comporta da mesma forma durante a electroforese, UV ou luz azul para a deteção de1. Além disso, enquanto outros corantes são mais sensíveis a concentrações muito baixas de DNA que EtBr ou TO, para experimentos de electroforese genéricos, tais corantes são proibitivamente caros, em muitos contextos.
Protocol
Representative Results
Discussion
Brometo de etídio tem sido uma ferramenta padrão no laboratório de biologia molecular, apesar de toxicidade conhecida. Ele também sofre de exigir que a luz UV, que danifica o ADN, como ele está sendo detectado. Laranja de tiazol oferece uma alternativa barata para brometo de etídio, bem como corantes comerciais úteis mas caros.
Os benefícios da laranja tiazol são, portanto, duas vezes. Primeiro, laranja tiazol simplesmente pode ser usada como um substituto para o brometo de etídio. G…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabalho foi financiado por fundos de inicialização a TDG de Christopher Newport University.
Materials
| 2-log DNA ladder | New England Biolabs | N0469S | |
| Agarose (Genetic Analysis Grade) | Fisher | BP1356-100 | |
| Blue-light flashlight | WAYLLSHINE (Amazon) | WAYLLSHINE Scalable Blue LED | |
| ChemiDoc MP | Biorad | 1708280 | |
| DMSO | Sigma-Aldrich | D8418 | |
| ethidium bromide | Fisher | BP1302-10 | For comparison, not necessary for protocol |
| Gel apparatus (Owl Easy Cast) | Thermo Scientific | B1A | |
| Qiagen Qiaquick Gel extraction kit | Qiagen | 28704 | |
| Safe Imager Viewing Glasses | Invitrogen | S37103 | Necessary for using blue light flashlight.* |
| SafeImager 2.0 (Blue light transilluminator) | Invitrogen | G6600 | Blue light flashlight may be used as alternative |
| SYBR Safe | Invitrogen | S33102 | For comparison, not necessary for protocol |
| TAE (Tris-Acetate-EDTA) | Corning | 46-010-CM | |
| Thiazole orange | Sigma-Aldrich | 390062 | |
| *Glasses are also included with Invitrogen G6600 |
Referenzen
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