Identificeren van aminozuur Overproducers met behulp van zeldzame-codon-Rich markers
Summary
Deze studie presenteert een alternatieve strategie voor de conventionele toxische analoge gebaseerde methode bij het identificeren van aminozuur overproducers door gebruik te maken van zeldzame-codon-rijke markers om tegelijkertijd nauwkeurigheid, gevoeligheid en hoge doorvoer te bereiken.
Abstract
Om te voldoen aan de steeds groeiende markt voor aminozuren, zijn high-performance productie stammen nodig. Het aminozuur overproducers worden conventioneel geïdentificeerd door het benutten van de competities tussen aminozuren en hun analogen. Echter, deze analoge gebaseerde methode is van lage nauwkeurigheid, en goede analogen voor specifieke aminozuren zijn beperkt. Hier presenteren we een alternatieve strategie die een accurate, gevoelige en high-throughput screening van aminozuur overproducers met behulp van zeldzame-codon-rijke markers mogelijk maakt. Deze strategie is geïnspireerd door het fenomeen van codon gebruik bias in eiwit vertaling, waarvoor Codons zijn onderverdeeld in gemeenschappelijke of zeldzame degenen op basis van hun frequentie van voorkomen in het coderen van DNA. De vertaling van zeldzame Codons hangt af van hun corresponderende zeldzame overdrachts rna’s (trna’s), die niet volledig kunnen worden opgeladen door de verwant aminozuren onder de honger. Theoretisch kan de zeldzame tRNAs worden opgeladen als er een overschot van de aminozuren is na het opladen van de synoniem gemeenschappelijke isoacceptors. Daarom kunnen vertraagde vertalingen veroorzaakt door zeldzame Codons worden hersteld door het voeden of intracellulaire overproducties van de overeenkomstige aminozuren. Onder deze aanname wordt een selectie-of screeningsysteem voor het identificeren van aminozuur overproducenten vastgesteld door de gemeenschappelijke Codons van de beoogde aminozuren te vervangen door hun synoniem zeldzame alternatieven in de antibioticaresistentie-genen of de genen coderen van fluorescerende of chromogene eiwitten. We tonen aan dat de eiwit uitdrukkingen sterk kunnen worden gehinderd door de opname van zeldzame Codons en dat de niveaus van eiwitten positief correleren met de aminozuur concentraties. Met behulp van dit systeem, overproducers van meerdere aminozuren kunnen gemakkelijk worden afgeschermd uit mutatie bibliotheken. Deze zeldzame-codon-gebaseerde strategie vereist slechts één gemodificeerd gen, en de gastheer is minder geneigd om te ontsnappen aan de selectie dan in andere methoden. Het biedt een alternatieve aanpak voor het verkrijgen van aminozuur overproducers.
Introduction
De huidige productie van aminozuren is sterk afhankelijk van fermentatie. Echter, de Antilichaamtiters en opbrengsten voor de meeste aminozuren productie stammen zijn onder de stijgende eisen van de wereldwijde aminozuur markt die miljarden dollars waard is1,2. Het verkrijgen van high-performance aminozuur overproducers zijn essentieel voor de upgrade van de aminozuur industrie.
Traditionele strategie voor het identificeren van aminozuur overproducers exploiteert de competities tussen aminozuren en hun analogen in eiwitsynthese3,4. Deze analogen zijn in staat om de Trna’s die de overeenkomstige aminozuren herkennen en dus remmen de rek van de peptide ketens, leidt tot gearresteerd groei of celdood5. Een manier om weerstand te bieden aan de analoge spanningen is het verhogen van de concentraties van intracellulaire aminozuren. De verrijkte aminozuren zullen de analogen voor de eindige Trna’s overtreffen en zorgen voor de juiste synthese van functionele eiwitten. Daarom kunnen stammen die de analogen overleven, worden geselecteerd en zijn ze waarschijnlijk de overproducenten van de overeenkomstige aminozuren.
Hoewel bewezen succesvol in het selecteren van overproducers voor aminozuren zoals L-leucine6, de analoge-gebaseerde strategie lijdt aan ernstige nadelen. Een belangrijk punt van zorg is de analoge weerstand die voortkomt uit het proces van mutagenese of door spontane mutaties. Stammen met resistentie kunnen ontsnappen aan de selectie door het blokkeren, exporteren of vernederende de analogen5. Een andere zorg is de toxische neveneffecten van de analogen op andere cellulaire processen7. Als gevolg daarvan, stammen die de analoge selectie overleven mogelijk niet het aminozuur overproducers, terwijl de gewenste overproducers kunnen worden ten onrechte uitgeroeid als gevolg van de negatieve bijwerkingen.
Hier wordt een nieuwe strategie op basis van de wet van codon bias gepresenteerd om nauwkeurige en snelle identificaties van aminozuur overproducers te bereiken. De meeste aminozuren worden gecodeerd door meer dan één nucleotide triplet die anders wordt begunstigd door de gastheerorganismen8,9. Sommige Codons worden zelden gebruikt in de codeer sequenties en worden de zeldzame Codons genoemd. Hun vertalingen in aminozuren vertrouwen op de verwant trna’s die de corresponderende aminozuren dragen. Echter, de Trna’s die zeldzame Codons herkennen hebben meestal veel lagere Abundances dan de Trna’s van de gemeenschappelijke Codons10,11. Bijgevolg zijn deze zeldzame Trna’s minder waarschijnlijk de vrije aminozuren vast te leggen in de competities met andere isoacceptoren, en vertalingen van de zeldzame-codon-rijke sequenties beginnen te vertragen of zelfs worden beëindigd wanneer de hoeveelheden aminozuren beperkt zijn 10. de vertalingen kunnen in theorie worden hersteld als er na het opladen van een aminozuur overschot de synoniem gebruikelijke Trna’s worden opgeladen als gevolg van overproducties of extra voedingen van de overeenkomstige aminozuren12. Als het zeldzame-codon-rijke gen een selectie-of screening marker codeert, kunnen stammen die de corresponderende fenotypes vertonen, gemakkelijk worden geïdentificeerd en zijn ze waarschijnlijk de overproducenten van de beoogde aminozuren.
De bovengenoemde strategie is van toepassing op de vaststelling van een selectie en een screeningsysteem voor de identificatie van aminozuur overproducenten. Het selectiesysteem gebruikt antibioticaresistentiegenen (bijv. kanR) als markers, terwijl het screenings systeem gebruik maakt van de genen codering fluorescentie (bijv. groen FLUORESCERENDE eiwitten [GFP]) of Chromogene (bijv. prancerpurple) eiwitten. De marker genen in beide systemen worden gewijzigd door het vervangen van gedefinieerde aantallen van de gemeenschappelijke Codons voor het beoogde aminozuur met zijn synoniem zeldzame alternatief. Stammen in de mutatie bibliotheek die het zeldzame-codon-rijke marker gen in de haven worden geselecteerd of gescreend onder de juiste omstandigheden, en de overproducenten van de beoogde aminozuren kunnen gemakkelijk worden geïdentificeerd. De werkstroom begint met de bouw van het zeldzame-codon-rijke marker gensysteem, gevolgd door de optimalisatie van de arbeidsomstandigheden, en vervolgens de identificatie en verificatie van het aminozuur overproducers. Deze analoge-onafhankelijke strategie is gebaseerd op het dogma in eiwit vertaling en is praktisch geverifieerd om nauwkeurige en snelle identificaties van aminozuur overproducers mogelijk te maken. Theoretisch, het kan rechtstreeks worden gebruikt om aminozuren met zeldzame Codons en alle micro-organismen. In alle, de zeldzame-codon gebaseerde strategie zal dienen als een efficiënt alternatief voor de conventionele analoge-gebaseerde aanpak wanneer de juiste analogen voor specifieke aminozuren niet beschikbaar zijn, of wanneer een hoge vals positief percentage is de grootste zorg. Het onderstaande protocol gebruikt Leucine rare codon om deze strategie te demonstreren bij de identificatie van Escherichia coli L-leucine overproducers.
Protocol
Representative Results
Discussion
Het aantal zeldzame Codons in de marker genen en het selectie-of screening medium is van cruciaal belang voor de remming van eiwit expressies uit de zeldzame-codon-gemodificeerde marker genen. Als er geen significant verschil kan worden gedetecteerd tussen eiwit uitdrukkingen van de wild-type marker genen en hun derivaten, kan het verhogen van het aantal zeldzame Codons of het gebruik van een nutriënt-beperkt medium de verschillen versterken. Echter, als het effect van de remming te sterk is, kunnen de eiwit uitdrukking…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Het werk werd gezamenlijk gesteund door de National Natural Science Foundation van China (Grant No. 21676026), het National key R & D-programma van China (Grant No. 2017YFD0201400), en de China postdoctorale Science Foundation (Grant No. 2017M620643). De werken in het UCLA Institute of vooruitgang (Suzhou) werden gesteund door de interne subsidies van de provincie Jiangsu en het Suzhou Industrial Park.
Materials
| Acetonitrile | Thermo | 51101 | |
| EasyPure HiPure Plasmid MiniPrep Kit | Transgen | EM111-01 | |
| EasyPure Quick Gel Extraction Kit | Transgen | EG101-01 | |
| Gibson assembly master mix | NEB | E2611S | |
| Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside | Solarbio | I8070 | |
| L-leucine | Sigma | L8000 | |
| Microplate reader | Biotek | Synergy 2 | |
| n-hexane | Thermo | H3061 | |
| Phenyl isothiocyanate | Sigma | P1034 | |
| PrancerPurple CPB-37-441 | ATUM | CPB-37-441 | |
| TransStar FastPfu Fly DNA polymerase | Transgen | AP231-01 | |
| Triethylamine | Sigma | T0886 | |
| Ultra-high performance liquid chromatography | Agilent | 1290 Infinity II | |
| Wild type C. glutamicum | ATCC | 13032 | |
| XL10-Gold E. coli competent cell | Agilent | 200314 | |
| ZORBAX RRHD Eclipse Plus C18 column | Agilent | 959759-902K |
Referenzen
- Tatsumi, N., Inui, M. . Corynebacterium glutamicum: biology and biotechnology. , (2012).
- Tonouchi, N., Ito, H., Yokota, A., Ikeda, M. Present global situation of amino acids in industry. Amino Acid Fermentation. , 3-14 (2017).
- Gusyatiner, M., Lunts, M., Kozlov, Y., Ivanovskaya, L., Voroshilova, E. . DNA coding for mutant isopropylmalate synthase, L-leucine-producing microorganism and method for producing L-leucine. , (2005).
- Park, J. H., Lee, S. Y. Towards systems metabolic engineering of microorganisms for amino acid production. Current Opinion in Biotechnology. 19 (5), 454-460 (2008).
- Norris, R., Lea, P. The use of amino acid analogues in biological studies. Science Progress. , 65-85 (1976).
- Park, J. H., Lee, S. Y. Fermentative production of branched chain amino acids: a focus on metabolic engineering. Applied Microbiology and Biotechnology. 85 (3), 491-506 (2010).
- Bach, T. M., Takagi, H. Properties, metabolisms, and applications of L-proline analogues. Applied Microbiology and Biotechnology. 97 (15), 6623-6634 (2013).
- Crick, F. H. C. On the genetic code. Science. 139 (3554), 461-464 (1963).
- Plotkin, J. B., Kudla, G. Synonymous but not the same: the causes and consequences of codon bias. Nature Reviews Genetics. 12 (1), 32-42 (2011).
- Dittmar, K. A., Sørensen, M. A., Elf, J., Ehrenberg, M., Pan, T. Selective charging of tRNA isoacceptors induced by amino‐acid starvation. EMBO Reports. 6 (2), 151-157 (2005).
- Elf, J., Nilsson, D., Tenson, T., Ehrenberg, M. Selective charging of tRNA isoacceptors explains patterns of codon usage. Science. 300 (5626), 1718-1722 (2003).
- Sørensen, M. A. Charging levels of four tRNA species in Escherichia coli Rel+ and Rel− strains during amino acid starvation: a simple model for the effect of ppGpp on translational accuracy. Journal of Molecular Biology. 307 (3), 785-798 (2001).
- Zheng, B., et al. Utilization of rare codon-rich markers for screening amino acid overproducers. Nature Communications. 9 (1), 3616 (2018).
- Richardson, S. M., Wheelan, S. J., Yarrington, R. M., Boeke, J. D. GeneDesign: rapid, automated design of multikilobase synthetic genes. Genome Research. 16 (4), 550-556 (2006).
- Xiong, A. -. S., et al. PCR-based accurate synthesis of long DNA sequences. Nature Protocols. 1 (2), 791-797 (2006).
- Gibson, D. G., et al. Enzymatic assembly of DNA molecules up to several hundred kilobases. Nature Methods. 6 (5), 343-345 (2009).
- Green, M. R., Sambrook, J. . Molecular cloning: a laboratory manual. , (2012).
- Cohen, S. A., Bidlingmeyer, B. A., Tarvin, T. L. PITC derivatives in amino acid analysis. Nature. 320 (6064), 769-770 (1986).
- Zhou, J., Liu, W. J., Peng, S. W., Sun, X. Y., Frazer, I. Papillomavirus capsid protein expression level depends on the match between codon usage and tRNA availability. Journal of Virology. 73 (6), 4972-4982 (1999).
- Gregg, C. J., et al. Rational optimization of tolC as a powerful dual selectable marker for genome engineering. Nucleic Acids Research. 42 (7), 4779-4790 (2014).
- Pelicic, V., Reyrat, J. M., Gicquel, B. Expression of the Bacillus subtilis sacB gene confers sucrose sensitivity on mycobacteria. Journal of Bacteriology. 178 (4), 1197-1199 (1996).
- Avcilar-Kucukgoze, I., et al. Discharging tRNAs: a tug of war between translation and detoxification in Escherichia coli. Nucleic Acids Research. 44 (17), 8324-8334 (2016).
- Mundhada, H., Schneider, K., Christensen, H. B., Nielsen, A. T. Engineering of high yield production of L-serine in Escherichia coli. Biotechnology and Bioengineering. 113 (4), 807-816 (2016).
- Makosky, P. C., Dahlberg, A. E. Spectinomycin resistance at site 1192 in 16S ribosomal RNA of E. coli: an analysis of three mutants. Biochimie. 69 (8), 885-889 (1987).
- Feng, L., Tumbula-Hansen, D., Toogood, H., Söll, D. Expanding tRNA recognition of a tRNA synthetase by a single amino acid change. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (10), 5676-5681 (2003).
- Naganuma, M., et al. The selective tRNA aminoacylation mechanism based on a single G• U pair. Nature. 510 (7506), 507 (2014).
- Hoesl, M. G., et al. Chemical evolution of a bacterial proteome. Angewandte Chemie International Edition. 54 (34), 10030-10034 (2015).
- Hershberg, R., Petrov, D. A. Selection on codon bias. Annual Review of Genetics. 42, 287-299 (2008).
- Huo, Y. -. X., et al. Conversion of proteins into biofuels by engineering nitrogen flux. Nature Biotechnology. 29, 346 (2011).
