JoVE Journal > Developmental Biology
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Ergebnisse
Discussion
Offenlegungen
Acknowledgements
Materials
Referenzen
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Entwicklungsbiologie

Kalsiyum akını, gözenek oluşumu ve P2X7 reseptörleri yetişkin nöral progenitör hücreler tarafından fagositoz araştırmak için gerçek zamanlı canlı hücre Akış Sitometresi

Published: April 03, 2019
doi:
10.3791/59313
, , , , ,
1Griffith Institute for Drug Discovery,Griffith University, 2Australian Institute for Bioengineering and Nanotechnology,University of Queensland, 3Discipline of Anatomy and Histology, School of Medical Science,University of Sydney, 4Bosch Institute,University of Sydney, 5Applied Neurosciences Program, Peter Duncan Neurosciences Research Unit,St. Vincent’s Centre for Applied Medical Research, 6School of Medical Sciences,The University of New South Wales (UNSW) Medicine, Sydney, New South Wales, 7School of Environment and Science,Griffith University, Brisbane, Queensland, 8Florey Institute of Neuroscience and Mental Health,University of Melbourne

Summary

Tek hücreli duyarlılığı sağlayarak, gerçek zamanlı Akış Sitometresi multimodal reseptör işlevleri canlı kültürlerin ölçmek için benzersiz olarak uygundur. Yetişkin nöral progenitör hücreler kullanarak, P2X7 reseptör işlevi tarafından elde kalsiyum göstergesi boya, transmembran gözenek oluşumu etidyum bromür alımı ve floresan lateks boncuk kullanarak fagositoz ile kalsiyum akını ile değerlendirildi.

Abstract

Canlı hücre Akış Sitometresi giderek içinde yaşayan bir biyolojik süreçleri ölçmek için hücre biyologları arasında kullanılan hücre kültür. Bu iletişim kuralı sayede canlı hücre Akış Sitometresi üzerine birden fazla işlevleri P2X7 reseptör etkinleştirme gerçek zamanlı olarak analiz etmek için genişletilir yöntemi açıklanır. Akış Sitometresi üzerinde yüklü bir zaman modülü kullanılarak, canlı hücre işlevi değerlendirildi ve kalsiyum akını, transmembran gözenek oluşumu ve fagositoz Kinetik keşfetmek için belirli bir zaman dilimi üzerinde çizilen. Bu basit yöntem olarak P2X7 reseptör tüm üç kurallı fonksiyonların bir makine kullanarak tespit edilebilir ve zaman içinde çizilen toplanan veri bilgi tek hücreli kayıtları yerine tüm canlı hücre popülasyonu üzerinde sık sık sağlar avantajlıdır Teknik olarak zor yama-kelepçe yöntemleri kullanarak elde. Kalsiyum akını deneyler bir kalsiyum göstergesi boya kullanın, transmembran geçmesine izin verilmesi arasında etidyum bromür P2X7 gözenek oluşumu deneyleri itimat iken yüksek agonist konsantrasyonları kurulan gözenek. Sarı-yeşil (YG) lateks boncuk fagositoz ölçmek için kullanılmaktadır. Belirli agonistleri ve antagonistleri P2X7 reseptör aktivite etkilerini araştırmak için uygulanır. Tek tek, bu yöntemlerin herhangi bir sayı kalsiyum kanalları ve purinergic ve çöpçü reseptörler Nicel veri sağlamak için değiştirilebilir. Birlikte ele alındığında, onlar gerçek zamanlı canlı hücre Akış Sitometresi kullanımı P2X7 reseptör işlevi araştırmak için hızlı, düşük maliyetli, tekrarlanabilir ve ölçülebilir bir yöntemi nasıl vurgulayın.

Introduction

Purinergic sinyal, geniş ve çok yönlü, hücresel fizyoloji, biyokimya ve Farmakoloji çalışmadır. Purinergic sinyal hücresel ve moleküler işlemlerini, kanser ve hücre-hücre iletişim ve kök hücre biyolojisi hücre döngüsü yönetmeliğine sonsuz sayıda ilişkidedir; Bu nedenle, orada sık sık bir terapötik yarar için sinyal purinergic modüle için bir potansiyel bulunmaktadır. Purinergic reseptörleri P2X7 reseptör önemli dikkat potansiyeli nedeniyle son yıllarda çok sayıda inflamatuar koşulları1tedavi hedefi olarak aldı. Reseptör çalışma yöntemleri gelişti ve yıllar içinde bu araştırma2,3,4,5kolaylaştırmak için adapte. Burada, P2X7 reseptörleri subventricular bölgesi (SVZ) ve Hipokampal dentat gyrus elde yetişkin nöral progenitör hücre içinde birden çok işlevlerini araştırmak için bir canlı hücre Akış Sitometresi yöntemi açıklanmaktadır.

P2X7 reseptör ilk P2Z reseptör veya maksimum 900 Da6moleküllere geçirgen bir büyük transmembran gözenek oluşumu adenozin trifosfat (ATP) sonuçlarında yüksek konsantrasyonları ile onun harekete geçirmek olarak ‘hücre ölümü’ reseptör olarak tanımlanmıştır. Bu hücre iskeleti düzenlenmesi için açar transmembran gözenek oluşumu ve büyük olasılıkla, Apoptozis ve/veya nekroz7. Geleneksel olarak, bu işlev P2X7 DNA3,8ile ara zaman bulabilsem YO-PRO-1 veya etidyum bromür gibi büyük molekül ağırlığı boyalar alımını tarafından sayılabilir. Hızlı ve yükseltme için izin, plaka okuyucu yöntemleri genel olarak Kinetik gözlem için izin vermez. Burada açıklanan yöntemi etidyum alımı üzerinde temel alır ve zaman içinde daha büyük bir derinlik gözenek oluşumu hızı ile ilgili olarak bilgi veren uyması gereken Floresans artış sağlar. P2X7 reseptörleri beri pozlama zaman ve agonist konsantrasyon9,10bağlı olarak farklı yanıt ile nonimmune fonksiyonları bir dizi kolaylaştırmak için gösterilmiştir. Harekete geçirmek katyon akını ATP sonuçlarının düşük konsantrasyonlarda tarafından nörotransmitter ve sinyal iletim11amaçlar için kısa. Kalsiyum akını ölçmek için Akış Sitometresi kullanarak hantal ve teknik olarak zor yöntemleri ile ilgili sorunları üstesinden gelir — özellikle, çok değerli ayrıntılı bilgi potansiyeli arasında değişiklik olarak içe akımlar ölçmek için sıkma yama hücre zarının ancak nüfus analizi2için izin vermez. ATP, nerede P2X7 reseptörleri fagositoz bağışıklık sistemi ve sinir sistemi9,12,13kolaylaştırmak için gösterilmiştir yokluğunda P2X7 reseptörlerinin üçüncü işlev oluşur. Her ne kadar miktar ve nüfus analizi hala bir meydan okuma sunabilirim mikroskobu teknikleri gelişmeler hücre iskeleti düzenlemeler görselleştirme Alım işlemi sırasında izin vermiş.

Burada ayrıntılı canlı hücre Akış Sitometresi yöntemi tüm üç ana fonksiyonları içinde gerçek-zaman P2X7 reseptörlerinin soruşturma olanak sağlar. Akış Sitometresi zaman modülü aygıtta eklenmesi sıcaklık kontrolü ve hücre süspansiyon sürekli karıştırma sağlar. Agonist ve antagonist uyaranlara hücresel yanıt kesintisiz çevre ölçümü sağlayarak bir saniye içinde teslim edilebilir. Bu tekrarlanarak işlevi birden çok tahlil sistemlerinin kullanımı kaçınarak ölçmek için hızlı ve basit bir yöntem sunuyor. Bu iletişim kuralı kolayca herhangi bir hücre tipi uygun uyarlanmış ve belirli agonistler veya inhibitörleri, onların özelliklerine bağlı olarak eklenmesi verilen diğer reseptör alt türlerinden incelemek için kullanılan olabilir unutmamak gerekir.

Protocol

Hayvanlar Avustralya uygulama kodu uygun olarak bakım ve kullanmak, hayvanlar için bilimsel amaçlar için tedavi ve Griffith Üniversitesi hayvan Etik Komitesi tarafından kullanım için onaylanmıştır. 1. Neurosphere kültür yetişkin SVZ ve Hipokampus nöral progenitör hücre Not: Burada sunulan diseksiyon Protokolü Walker ve Kempermann tarafından çalışmaları temel ve yetişkin fareler nöral progenitör hücrelerin diseksiyon için detaylı bir protokol başka bir yerde kullanılabilir14. Kültür koşulları bal ve arkadaşları15değiştirildi. 8-12 hafta yaşlı yetişkin kadın C57BL/6 fareler kullanıldı. Bir biyolojik Emanet dolabı, kültür nöral Kök Hücre proliferasyonu ek, 2 mM glutamin, 20 ng/mL epidermal büyüme faktörü (EGF), 10 ng/mL temel fibroblast büyüme faktörü (bFGF) ve 2 µg/mL ile desteklenmiş orta (sinirsel Bazal orta) hazırlamak heparin. İki fare CO2 inhalasyon tarafından ötenazi. Alternatif olarak, kurumsal esaslarına göre fareler anestezi ve hemen onları tarafından servikal çıkığı ötenazi. Başlarını % 70 etanol ile sprey ve onları başını kesmek. Her kafa Hank’in dengeli tuz solüsyonu (HBSS) içeren bir steril tüp 1 x penisilin/streptomisin çözüm (P/S) ile aktarın. Gruptakiler laminar akış başlık diseksiyon mikroskop altında gerçekleştirin. Forseps ve diseksiyon makası kullanarak, doku ve kemik beyin açığa çıkarmak ve HBSS P/s ile içeren steril bir tabak transfer Beyin ventral yan yukarı getirin ve optik hemisferlerine arasında tam bir koronal kesi yapmak bir neşter bıçak kullanın. Beyin Forseps ile sabit tutun ve aşağı doğru hareket hızlı, temiz, kullanın. Hücre ölümü en aza indirmek ve doku yapısı korumaya yardımcı olmak için testere kaçının.Not: Güvenli bir şekilde değil tutarsa, beyin ileriye eğimli kesim sırasında SVZ elde progenitör hücre sayısı ödün. SVZ beyin rostral yarısı üzerinden ayırma. Her iki ventrikül septum tarafından üstlerindeki beyaz bir köprü oluşturan corpus callosum ile ayrılmış, bulun. Forseps ayıran iki ventrikül septum kaldırmak ve ön lateral ventrikül lateral duvarları izole etmek için kullanın. Bunu uzaklara yukarıda, aşağıda, iki yanda ve ön ince diseksiyon makasla kesme. Küçük bir fincan benzeri şekli kalacaktır. Orta HBSS birkaç damla temiz Petri kabına kapaklı hazırlayacak ve SVZ sıvıya transfer. Kuru veya kuru yüzeye dokunun doku izin vermez. Tarafına hippocampi diseksiyon sırasında hazır. Hippocampi beyin Kaudal yarısı üzerinden ayırma. Corpus callosum koparmaya hemisferlerin arasında kesin bir orta çizgi olun. Lateral ventrikül bir kılavuz olarak kullanın ve yavaşça hipokampüs ortaya çıkarmak için korteks açılmak. Korteks unrolled edildikten sonra Hipokampus yoğun, beyaz, eğimli yapısı olarak görülebilir. İnce diseksiyon makası veya forseps Hipokampus komşu dokusundan ayırmak için kullanın. Forseps ile aşırı beyaz madde, kan damarları ve membranöz herhangi bir doku oluşur kapsayan kaldırın. HBSS birkaç damla ile hazırlanan bir temiz Petri kabına kapak hazırlayacak ve Hipokampus sıvıya transfer. Diğer Yarımküre için yineleyin. Bir kez oluşur ve iki fare üzerinden SVZ edilmiş izole ve onların anılan sıraya göre Petri kabına kapakları için transfer, mekanik bir neşter bıçak kullanarak doku zar. Bir Petri kabına kapağı yaklaşık 1 dk için doku doğrayın, döner her 10 doku pürüzsüz görünene kadar s ve sadece iyi parça kalır. Bir temiz neşter bıçak almak ve doku için 1 dk dicing diğer yemek için yineleyin. 1 mL pipet kullanarak, tüm doku 1 mL % 0.25 tripsin-ethylenediaminetetraacetic asit (EDTA) içeren tüpler ayırmak için her Petri kabına kapak transfer. Bir tüp SVZ ve Hipokampus için bir tüp için kullanın. Bunu tarafından ilk tripsin-EDTA doku hava kabarcıkları en aza indirmek için ve bu tüp transfer edilir gibi kuru pipet ucu ile temas geliyor doku önlemek için tabak içinde yaklaşık yarısı pipetting. Çanak ve toplamak mümkün olduğunca çok doku ve tüp eklemek için tripsin EDTA kalan neşter bıçakla durulayın. 30 dk, düzgün doku ayırmak için tüp her 10 min kışkırtmaktan için 37 ° C su banyosunda tripsin dokuyla kuluçkaya. Bir tek hücre süspansiyon oluşturmak için bir yangın cilalı cam Pasteur pipet kullanarak doku triturate. Bu aşırı hücre lizis neden olur gibi overtriturate değil için dikkat ediniz. Bu en uygun doku ayrılma için kritik bir adımdır. Tüp içeriği toz işlemi sırasında gözlemlemek ve doku kümeleri çoğunluğu kaldırılmıştır erken işaretler kes. Hücreleri tek hücre süspansiyon gitti zaman tripsin çözüm bazı kümeleri kalabilir, ancak biraz bulutlu hale gelmelidir.Not: Bir göstergesi olarak, aşağı yukarı 10 x-15 x süspansiyon geçen yeterlidir. Kültür orta eklemek tripsin etkisiz hale getirmek ve 300 x g 3 dk. yıkama için de başka bir spin için 5 mL 2 x HBSS ve pass ile orta herhangi bir doku kaldırmak için bir 70 µm hücre süzgeç aracılığıyla kümeler. Orta 15 mL tüm hücrelerde bir T75 hücre kültür şişesi aktarın.Not: Küreler sıfır (P0) pasajda oluşturmak SVZ kültür 7-10 gün sonra ve Hipokampal kültür 15-20 gün sonra. Yıkama veya hücreler nöral progenitör hücre kültüründe sayısı en üst düzeye çıkarmak için bu dönemde besleme kaçınmak. Eğer daha fazla ataları gereklidir veya P0 kuluçka zamanı azaltmak için feda fareler sayısını artırmak mümkündür. 37 ° c % 5 CO2 ve ilk P0 kültür aşaması takip kültürleri korumak, her 7-10 günde bir biyolojik güvenlik kabin ve çift doku kültürü yöntemleri kullanarak gerektiğinde geçiş.Not: P0 Hipokampal kültür geçiş için yeterli küreler T25 şişesi oluştursun; SVZ kültür pek çok daha fazla küreler oluşturur ve bir T75 passaged. P0 Hipokampal küreler yapıştırılır, 200 µL pipet yavaşça küre kaldırmak için kullanın. 150 ila 200 µm çapında ulaştığınızda küreler geçiş. Bu küreler ve orta 15 mL tüp içinde toplamak ve yerçekimi tarafından yaklaşık 5 dk. için alternatif olarak yerleşmek, bir düşük hızda (100 x g) 2 min için spin küreler sağlar. Orta kaldırmak ve ayrılma reaktif küreler büyüklüğüne bağlı olarak 7-10 dk için hücrelerle ayırmak.Not: Kullanılan ayrılma reaktif Yani kültür sonucu üzerinde önemli etkileri olacaktır Malzemeler tablo özellikleri için başvurun. Hücreleri hücre çözümü ve 300 x g , santrifüj 3 dakika süreyle 5 mL HBSS de ekleyerek süpernatant kaldırmak, kültür orta hücrelerde resuspend ve orta T25 hücre kültür şişesi veya eşdeğer 5 mL yaklaşık 150.000 hücrelerde, tohum yıkama. 37 ° C ve % 5 CO2kültürleri korumak. Nöral progenitör hücre durumu herhangi bir aşağı akım protokolü9geçmeden önce kök hücre işaretleri Sox2 ve ASCL1 gibi bir ifade belirleyerek doğrulayın.Not: Bu araştırmacı tercih edilen yöntem (örneğin, İmmünokimya mikroskobu, Akış Sitometresi veya Batı leke veya nicel Polimeraz zincir reaksiyonu (qPCR) kullanarak) tarafından yapılabilir. 2. Akış Sitometresi göre analiz için bir tek hücre süspansiyon hazırlanması Gerekli ortam hazırlamak. Bunlar aşağıdakileri içerir. Na+ orta 145 mM NaCl, 5 mM KOH, 10 mM HEPES, 5 mM D-glikoz, % 0,1 sığır serum albumin (BSA) ve 0,1 mM CaCl2içeren hazır olun. Bu orta de 0,1 mM atlanmış CaCl2 ile kalsiyum-Alerjik bir form kullanılır. 145 mM KCl, 5 mM KOH, 10 mM HEPES, 5 mM D-glukoz ve % 0.1 BSA içeren K+ orta hazırlayın.Not: Bu medya ve kapsamlı bir şekilde optimize önceki yayınları4,5′ te ayrıntılı olarak açıklanmıştır. Hisse senedi ATP 100 mM stokunun yaklaşık 20 mL için yeterli ATP toz ağırlığında tarafından hazırlayın. KCl arabellek (145 mM KCl, 5 mM KOH ve 10 mM HEPES, pH 7.5) 17 ml toz geçiyoruz ve yavaş yavaş, karıştırma sırasında % 18 (w/v) tetramethylammonium hidroksit (TMA) 2 mL pH 6.8-7.0 için getirmek için çözüm ekleyin. 20 ml nihai ses düzeyini ayarlayın. PH 7,0 geçmiş aşma değil. Hisse senedi-80 ° C’de depolar; ATP aliquots en az 6 ay için kararlı olduğunu unutmayın.Not: Susuz ATP ücretsiz molekül ağırlığı 551.14 g/mol olduğunu ve bu toplu iş toplu değişiklik gösterebilir ve hesaplamalar için dikkate alınması gereken su ve disodyum molekül molekül ağırlığı içermez. TMA zehirli olduğunu ve işlerken özen göstermelidir. Güvenlik veri sayfası ve bir duman kabine hisselerinde hazırlamak okuyun. Hisse senedi BzATP BzATP ultrasaf H2O 10 mM bir son hisse senedi konsantrasyon için çözülerek hazırlayın. Bir tek hücre süspansiyon 1.16 ve 1.17 adımlarda açıklandığı gibi oluşturun. Bir hemasitometre veya otomatik hücre sayacı kullanarak hücreleri saymak. (Aşağıda açıklandığı gibi) yürütülen deneme için gerekli ortamı (örneğin, Na+ orta, kültür orta) hücrelerde resuspend ve hücreleri bu arada Buza koyun. Her deneme için kalibrasyon gerilim ve tazminat ayarlarının yanı sıra, ön ve yan dağılım için denetimleri eklemek için yeterli örnek olduğundan emin olun. Dikkat, bir göstergesi olarak, genellikle bir T75 şişesi yetiştirilen küreler şişe başına yaklaşık 8 x 106 hücre verim. Akış Sitometresi ayarları kontrol örnekleri kullanarak ayarlayın. Ön ve yan dağılım seçmeli olarak canlı hücreler kapı için kullanın.Not: İleri dağılım yan dağılım iç karmaşıklık veya taneciklik ölçü sağlarken hafif kırınım üzerinde bağlı hücre boyutu ile ilgili bilgi sağlar. Akışı olayları kısa forvet ve yan dağılım ölü hücreler olarak düşünülebilir. Gerilim ayarlamak ve üreticinin yönergelerine göre Akış Sitometresi ve kazanç. Maksimum floresan yoğunluğu veri yakalama sağlamak için bir deneme örnek çalıştırın. Hiçbir tazminat tek kanal satın almalar için gereklidir. 3. ölçme kalsiyum akını Live-hücre Akış Sitometresi Bir tek hücre süspansiyon hazırlanması, 1 mL kalsiyum-Alerjik Na+ orta hücrelerde resuspend ve onları 2 ng/mL kalsiyum göstergesi boya üreticisinin protokolüne göre yükleyin ( Tablo malzemeleriçin başvurmak) ile 10 µL %5 pluronic asit. 37 ° C’de 30 dk için hücreleri kuluçkaya 3-5 mL kalsiyum-Alerjik Na+ orta ekleme ve yavaşça centrifuging hücreleri yıkayın (200 x g 4 dk için). Süpernatant kaldırın ve ikinci kez yıkama Na+ orta kalsiyum-Alerjik, hücrelerde resuspend. 1 mL kalsiyum-Alerjik Na+ orta hücrelerde resuspend, Buza koyun ve 30 dk için de-esterify etmelerine izin. 1 x 3-5 mL K+ orta ekleyerek ve (200 x g için 4 dk); centrifuging daha fazla yıkama sonra K+ orta ve aliquot hücreleri floresan FACS tüp başına 500 µL başına 1 x 106 hücre bir konsantrasyon, yardımlı hücre (FACS) sıralama tüpler içine onları resuspend.Not: Örnek başına FACS tüpler sayısı tedaviler sayısına bağlıdır ve içerdiği yinelenir. Hücreleri çözümlenmesi hazır olana FACS tüpler Buza koyun. Hücreleri buza uzun bir süre için terk etmeyin ama tahlil en kısa zamanda başlar. Bazı örnekler için P2X7 reseptör özgü inhibitörü AZ10606120 hücrelerle preincubate (10-15 dk 1 µM) veya A438079 (30 dk 10 µM) analiz önce 37 ° C’de. İlk örnek çalıştırmadan önce bir kaç dakika CaCl2 (1 mM FACS tüp içinde son bir konsantrasyon) ekleyin ve kurtarmak için bir 37 ° C su banyosunda tüpü yerleştirin. Temiz bir damla, dolaşımdaki 37 ° C su banyosu numune sıcaklığı kontrol etmek için zaman modülü tüpte FACS tüp ve pozisyon içine küçük manyetik karıştırıcı bağlantılı. Bir girdap etkisi tanıtımı olmadan hareket örnek sağlamak için düşük bir karıştırma hızı seçin. Su ceketi tüp bağdaştırıcısı örnek platformu üzerine yerleştirin ve kol kol FACS makinenin kapatın. Örnek alma başlatmak ve saniyede yaklaşık 1000 etkinliklerde örnek 3 dk için çalıştırın. 40 s işareti, hızlı bir şekilde tüpü çıkarması ve P2X7 agonist ekleyin 1 mM ATP veya 300 µM BzATP ve satın alma devam etmek için tüp değiştirme. İlk örnek kayıt ederken CaCl2 ikinci örnek hazırlamak ve 37 ° C hücrelere analiz önce ısınmak için yeterli zaman tanımak için yere koyun. İlk örnek tamamladığında, bir su örneği çalıştırarak alımı temiz ve ikinci örnek edinimi 3.8 ve 3.9 adımlarda açıklandığı gibi o zaman başlayabilirsiniz. Her zaman örnek arasında alımı temiz. 4. gözenek oluşumu canlı hücre Akış Sitometresi ile ölçme Bir tek hücre süspansiyon 1.16 ve 1.17 adımlarda açıklandığı gibi oluşturun. Bir kaç eski orta mililitre kaydetmek, FACS tüp başına 100 µL başına 1 x 106 hücre bir konsantrasyon hücreleri resuspend için kullanın ve hazır kadar buz üzerinde yerleştirin. Tahlil çalıştırmadan önce 900 µL K+ orta son hacim 1 ml için eklemek ve tüpler 37 ° C su banyosu kurtarmak 10 dakika yerleştirin. Tedaviler, P2X7 özgü inhibitörleri AZ10606120 de dahil olmak üzere içeren hücreleri (varsa), preincubate (10-15 dk 1 µM) veya A438079 (30 dk 10 µM). Hemen tahlil çalıştırmadan önce 25 µM arasında etidyum bromür FACS tüp ekleyin; o zaman, manyetik karıştırıcı ekleyebilir FACS makine adım 3.7 göre yerleştirin ve satın alma başlar.Not: Etidyum bromür toksik ve bu işlerken özen göstermelidir. Kullanılan FACS lastikler uygun şekilde atın. Hücre zarının gözenekleri oluşumu ikna etmek için Alım başladıktan sonra 1 mM ATP veya 100 µM BzATP 40 s ekleyin. 6 dk için saniyede yaklaşık 1000 etkinliklerde örnekleri çalıştırmak. İlk örnek çalıştırılırken, buz ikinci örnek alıp hücrelere analiz önce kurtarmak için yeterli zaman tanımak için 37 ° C su banyosunda yerleştirin. İlk örnek alımı su örneği çalıştırarak temiz satın alma tamamlandıktan sonra; daha sonra ikinci örnek 3.8 ve 3.9 adımlarda açıklandığı gibi kaydetmeye başlamak için makine üzerinde yerleştirilebilir. 5. fagositoz canlı hücre Akış Sitometresi tarafından ölçme Bir tek hücre süspansiyon 1.16 ve 1.17 adımlarda açıklandığı gibi oluşturun. Klimalı orta ve onlara FACS tüpler FACS tüp başına 100 µL başına en az 1 x 106 hücre bir konsantrasyon, aliquot hücrelerde resuspend. 1 x 106 hücre/mL Na+ orta ile son bir konsantrasyon hücrelere seyreltik (örneğin, 900 µL Na+ orta eklemek) ve çözümleme yapılır kadar hücreleri Buza koyun. YG lateks boncuk (mikroküreler) 1 µm fagositik hedef olarak gerçek zamanlı fagositoz deneyleri için kullanın.Not: Diğer renkleri de yerine olabilir, ama farklı ölçekli boncuk fagositoz4yetersiz hedefler bulundu. İlk örnek çalıştırmadan önce hücreleri 37 ° C su banyosu aktarmak ve onlar için yaklaşık 7-10 dk hücreleri kurtarmak izin vermek kuluçkaya. 40 dk, 20 µM cytochalasin D 20 dk ve % 4 paraformaldehyde (PFA) 20 dk için ATP (oxATP) 300 µM okside, 1 mM ATP 15dk için de dahil olmak üzere onların anılan sıraya göre tüpler için preincubation gerektiren herhangi bir tedavi ekleyin. Hiçbir preincubation % 5 insan serumu için gereklidir. Tedaviler yaklaşık aynı zamanda eklenmişse, diğerleri kuluçkaya devam ederken örnekleri ters sırada çalıştırılabilir. Örneğin, denetimler ve serum, sonra cytochalasin D ve İngiltere’de yılın ve oxATP son ardından ATP tedavi örnek çalıştırın. Örnek 3.8 ve 3.9 adımlarda açıklandığı gibi manyetik karıştırıcı ile sitometresi yerleştirin ve sonra örnek alma başlatın. Örnek tüp Alım başladıktan sonra 15-20 s makineden çıkarın ve su katılmamış YG Boncuk 5 µL ekleyin. Örnek FACS tüp dönmek ve satın alma devam etmek. 7-8 dk için örnekleri yaklaşık 1000 olayları/s çalıştırın. İlk örnek çalıştırılırken, buz ikinci örnek alıp hücrelere analiz önce kurtarmak için yeterli zaman tanımak için bir 37 ° C su banyosunda yerleştirin. İlk örnek bittiğinde, su örneği çalıştırarak alımı temiz ve ikinci örnek üzerinde edinme 3.8 ve 3.9 adımlarda açıklandığı gibi başlayın. 6. veri analizi Verileri elektronik tabloya verme. Veri analizi deneysel soruda bağlı olacaktır.Not: Tahlil için belirlenen zaman başında çalıştırmak önemlidir bu yüzden farklı çalışır farklı temel yoğunluklarını, olabilir unutmayın (yaklaşık 40 s) herhangi bir agonistler eklemeden önce ve floresan (floresan değişimi hesaplayarak verileri normalleştirmek için herhangi bir zamanda Floresans [F0] zamanda noktada sıfır veya F/F0 tarafından bölünmüş zaman noktası [F] verilir). Oranı veya Kinetik söz konusu P2X7 işlevinin ölçmek için eğri veya her 10 s zaman dönem16için eğri altındaki oluşturulan trapezoids toplamı alanında hesaplayın. Tedavi etkilerini belirlemek için floresan yoğunluğu kayıt son 10-20 s ortalama ve tedaviler karşılaştırmak. Ttarafından önemini belirlemek-test veya Varyans analizi.

Representative Results

Nöral progenitör hücre kültürleri Bu yöntemi kullanarak elde edilen nöral progenitör küre kültürler faz parlak olmalı ve düz yuvarlak kenar (şekil 1AB) sahip. Sağlıklı kültürlerde, küçük microspikes kenarları (şekil 1 c) görülebilir. Geç pasajlar, ya yetersiz beslenen, içi boş Kupası şekli (şekil 1 d) veya büyük dikdörtgen şekiller (şekil 1E,) okla gösterilen küreler oluşturabilir. Bu kültürler kullanılmaması gereken Akış Sitometresi veya herhangi bir aşağı akım diğer uygulamalar için bu özellikleri Bu farklılaşma göstergesi olabilir. Nöral progenitör durumu onaylamak için hücreleri Poli-L-Ornitin ve laminin immunocytochemistry için kaplanmış cam coverslips üzerinde kaplama (şekil 1F ve daha yüksek confluency, şekil 1G). Hücreler için testin, Sox2, vimentin, ASCL1, BLBP, Prox1 ve DCX tip 2 progenitör hücre (Hipokampus) veya Type C progenitör hücre (SVZ)9hücreleri tanımlamak için GFAP’nin, lekeli. Hücreleri iyi tanımlanmış bir çekirdek ve genişletilmiş işlemler olmalıdır. Şekil 1: temsilcisi Hipokampal nöral progenitör hücre kültürü. (A)Hipokampal nöral progenitör hücre yetişkin fareler izole ve neurospheres yaklaşık 100-150 µm çapı kadar kültürlü. (B) Neurospheres-meli-si olmak düz bir çevre, (C) ve küçük microspikes-ebilmek var olmak onların yüzey üzerinde görülmektedir. Küreler kültüründe çok uzun olduğunda, (D)-fincan veya (E) dikdörtgen şekiller oluşturabilir. Bu kültürler deneyler için kullanılmamalıdır. Hücreler nöral progenitör durumunu doğrulamak için Poli-L-Ornitin (PLO) ve laminin kaplı cam coverslips İmmünokimya için tek hücreli uzaklaştırılmış olarak tohum. Hücreleri küçük soma ve dallanma süreçler, (F) düşük confluency ve (G) İmmünokimya için hazır olması gerekir. Ölçek çubukları 100 µm. = Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız. Kalsiyum akını tarafından canlı hücre Akış Sitometresi Bu iletişim kuralı P2X7 reseptör işlev analiz için bir kalsiyum kanal gerçek zamanlı olarak sağlar. Kinetik reseptör işlevinin yanı sıra farklı agonistleri ve antagonistleri, etkileri de değerlendirilebilir. Ne zaman üzerine çizilen sefere kalsiyum akını Hipokampal içinde ve SVZ nöral progenitör hücre genellikle benzer (şekil 2A ve şekil 2B, sırasıyla). Agonistler (ATP veya BzATP) kırmızı okla gösterilen 40 s işareti olarak eklenmiştir. Kısa bir an için tüp sıfır veri noktaları olarak sonuçlanan agonist eklemek için kayıt noktası kaldırılır. Bu otelde agonist eklendiği saat tanımlaması için izin verir. BzATP iyon kanal açma ve Fluo-8’e bağlanır ve fluoresces kalsiyum akını izin P2X7 reseptörleri, hızla harekete geçirmek. ATP uygulama genel olarak daha yavaş yavaş bir kalsiyum akın sonuçları. Bu BzATP için karşılaştırıldığında P2X7 için daha düşük bir yakınlık ve de G-protein-birleştiğinde reseptörü harekete geçirmek, kalsiyum endoplazmik retikulum gelen bültenleri bir daha yavaş sinyal yolu neden olur. P2X7 antagonistleri A438079 ve AZ10606120 dahil (veri gösterilmez) kalsiyum akını agonist uygulama yanıt olarak azalır. Şekil 2: canlı hücre içi kalsiyum akını nöral progenitör hücrelerin Hipokampus ve SVZ. P2X7 reseptör kalsiyum kanal işlevi göstermiştir (A) Hipokampal ve (B) SVZ elde edilen progenitör hücre Fluo-8 Floresan değişikliklerden. Uygulama genel P2X agonist ATP ve açma, kalsiyum akını izin P2X7 iyon kanalları P2X7 agonist BzATP sonuçlanır. Akın A438079 veya AZ10606120 P2X7 özgü işlemcimiz engellendi (veri gösterilmez). F Floresans; = F0 Floresans zamanda noktada sıfır =. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız. Gözenek oluşumu ile canlı hücre Akış Sitometresi Transmembran gözenek oluşumu P2X7 reseptörleri, makromolekül Satım, sonuçlarında, kurallı bir özelliğidir ve hücre ölüme sebep olabilir. Etidyum+ sağlıklı hücreleri hariç büyük bir molekül (314 Da) olduğunu; onun alımı ve DNA ile sonraki enterkalasyon floresan emisyonu sonuçları ve P2X7 reseptörleri transmembran gözenekleri formu yeteneği değerlendirmek için kullanılabilir. Agonistler ATP (1 mM ATP) ve BzATP uygulanması takip (100 mikron) 40 s (okla gösterilen), zaman-çözüldü Akış Sitometresi hücreleri gerçek zamanlı (şekil 3Aiçinde) girerek etidyum bromür yakalar. Bu etkiyi P2X7 özgü inhibitörü AZ10606120 tarafından zayıflatılmış. Etidyum bromür alımını tahlil bir fonksiyonel P2X7 reseptör C-terminus17 gösterir ve tam uzunlukta P2X7 reseptör ifade için iyi kanıtıdır. ATP konsantrasyon-yanıt deneyleri agonist konsantrasyon P2X7 gözenek oluşumu, etidyum bromür floresan (şekil 3B) zamanla değişim kullanarak üzerinde etkilerini göstermektedir. Agonist doz konsantrasyon eğrileri reseptör özgü inhibitörleri ile birlikte reseptörü harekete geçirmek için güçlü kanıtlar sağlamak. Şekil 3: P2X7 transmembran gözenek oluşumu etidyum alımı tarafından ölçülen. Etidyum bromür anlar edinme başlangıcından önce eklenmesi P2X7 transmembran gözenekleri oluşumu ölçmek için kullanılır. (A)P2X7 reseptör ATP ve BzATP sonucu yüksek konsantrasyonda gözenek oluşumu, etidyum bromür hücre girmek izin. P2X7 inhibitörü AZ10606120 bu olay zayıflar ve fonksiyonel P2X7 reseptörleri için kanıt sağlar. (B) ATP konsantrasyon-yanıt deneyleri önemli gözenek oluşumu 500 mikron ve 1 mM ancak düşük konsantrasyonlarda gösterdi. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız. Canlı hücre Akış Sitometresi tarafından fagositoz Bizim grup daha önce hücre dışı ATP P2X7 C-terminus sitoiskeleti dan dissociating tarafından P2X7-aracılı fagositoz engeller göstermiştir özellikle, nonmuscle myosin IIA18,19. P2X7 reseptör katılımı fagositoz tarafından Hipokampal göstermek için bu bulgular bu yöntem ortalamalı ve gerçek zamanlı (şekil 4′ te, Hipokampal fagositoz örneği) SVZ nöral progenitör hücre. Sınır tanımayan fagositoz (kontrol) düzeyleri 1 µm YG lateks boncuk pozitif kontrol olarak kuruldu. Tüm doğuştan gelen fagositoz5 serum kaldırılmış iken ATP YG boncuk fagositoz olarak nonspesifik inhibitörleri, yani İngiltere’de yılın fiksasyon ve aktin polimerizasyon inhibitörü cytochalasin D, aynı derecede inhibe. Şekil 4: sinirsel ataları P2X7 reseptörleri üzerinden fagositik kapasite gösteren YG boncuk alımını. YG boncuk alımını nöral progenitör hücreler tarafından canlı hücre kullanarak gözlemlenebilir olduğunu Akış Sitometresi gerçek zamanlı olarak. Fagositoz düzeyde denetim başlangıçta kurulan ve hücre sayısı izin veriyorsa, Çalıştır sonunda teyit. Bu C-terminus P2X7-aracılı hücre iskeleti düzenlemeler önleme membran sitoiskeleti üzerinden ayrışıp gibi P2X7 reseptörleri katılımı fagositoz ATP, huzurunda inhibisyonu ile belirtilir. ATP uygulanması fagositoz nonspesifik fagositoz, paraformaldehyde (PFA) ve cytochalasin D (CytD) de dahil olmak üzere inhibitörleri kullanımı olarak aynı ölçüde engelledi. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Discussion

Bu kağıt nöral progenitör hücre kültürlerinde yetişkin Nörojenik nişler türetilmiş P2X7 reseptör işlevi analizi için detaylı bir protokolü sunar. Potansiyel uygulamalar için yetişkin nöral progenitör hücrelerin tedavi amacıyla araştırma arasında değişir ve kültür yöntem güçlü ve tekrarlanabilir kadar olmalıdır. Bitiş noktası kültür kalitesini etkileyebilir bu iletişim kuralı için önemli yönleri vardır. Bir kez kafatasından çıkarmak, beyin kurumaya verilmemeli ve diseksiyon kısa zamanda yapılmalıdır. Özellikle hipokampüs ile herhangi bir kan damarları veya membranöz doku kaldırmak için alınan ekstra bakım üstün progenitör hücre verimleri neden olur. Ayrılma ve toz işleminin ağır bir kültürde elde edilen küre sayısını etkileyebilir; Tripsin-EDTA ile kuluçka sırasında doku Tantanacı daha homojen bir çözümde neden olur. Yangın cilalı cam kullanımı emekliye pipet üzerinde bir P1000 plastik pipet ucu ortaya çıkan kültür geliştirmek ve hücre ölümü azaltmak için önerilir. Overtriturating kaçının. Bu önlemler rağmen yordamı P0 kültüründe enkaz bir sürü oluşturabilirsiniz ve küreler oluşturdular kadar-meli var olmak kaçmak progenitör hücre kaybetme, yıkama veya kültür besleme önlemek için.

Hipokampal arasındaki farklardan ve SVZ kültürler P0 belli olacak. Hipokampal kültürleri daha az küreler verim ve bunlar genellikle uygun. Pipet ucu hafifçe küreler ilk geçiş için kapalı kaldırmak için kullanın. Yapisan küreler sonraki pasajlar gözlenen değil. Doku kültürü şişeler farklı markalar küreler, neden olabilir uygun ve yemeğin altındaki koloniler olarak büyümek için özellikle Hipokampal küreler. Bu alter herhangi bir aşağı akım sonuçları bu iletişim kuralı için bulunamadı ama takip edilmelidir ve tutarlılık mümkün olan yerlerde saklanması gerekebilir.

Önceki yöntemleri kalsiyum akını, kaydetmek için sıkma yama gibi P2X7 reseptör işlevi ölçmek için kullanılan zaman alan ve zahmetli ve sadece tek bir hücre üzerinde bilgi sağlayabilir. Bu iletişim kuralı bir makine kullanarak P2X7 reseptörleri tüm üç ana fonksiyonları çözümlemek için hızlı ve tekrarlanabilir bir yöntem sunuyor. Canlı hücre akışı zaman çözüldü sitometresi bütün nüfus analizi için ve araştırmacı Kinetik ilgili bilgilerle kalsiyum akını, gözenek oluşumu ve/veya fagositik işlevi sağlar. Buna ek olarak, Akış Sitometresi kolayca marker ifade desenleri ve nüfus analizi hücre boyutunu veya protein ifade düzeylerine göre değerlendirmek için bir yöntem olarak kullanılabilir.

Ne zaman bu deneyler, maksimal kalsiyum akını, etidyum alımı ya da fagositoz oranları farklılıkları tekrarlar arasında gözlenen. Hücreleri sağlık elde edilen sonuçlar üzerinde önemli bir etkisi olacak gibi bu küre boyutu en aza indirmek için kültür koşulları ve rejim besleme tutarlı olması gerekir. Buz zamanında da verileri, çok etkileyebilir zaman buz üzerinde en az düzeyde, böylece her şeyi vaktinden hazırlanmıştır olun. Yükleme süresi kalsiyum göstergesi boya tutarlı olduğundan emin olun. Maksimal kalsiyum kayıtları büyük tutarsızlıklarına neden olabilir başka bir faktör ATP toplu işlemleri arasında çeşididir. ATP stokları hazırlanması çok önemlidir ve aynı deneyler için farklı toplu işlemleri kullanımını kaçınılmalıdır. ATP tutarlı olduğundan emin olmak için eski ve yeni toplu işlemleri karşılaştırma da önerilir. Kuluçka süreleri ve konsantrasyonları duruma getirilmesi gerekli olabilir bu yüzden P2X7 antagonistleri etkinliğini hücre satır ve toplu bağımlı, de kullanabilirsiniz.

Bu o kalsiyum akın/sızma en temel ve karmaşık hücresel işlevlerinden biridir ve tarafından birçok reseptörler aracılı dikkati çekiyor. ATP kaynaklı kalsiyum akını ATP klasik bir ölçüm için P2X7 kanal/gözenek işlevi, doğru bir şekilde yansıtabilir değil gibi P2X7 reseptörlerinin doğru işlev hücre içi kalsiyum serbest bırakmak için P2Y reseptörleri de etkinleştirebilir. Bu durumda, baryum, akın tek yönlü16olarak kalsiyum yerine kullanılmak üzere daha iyi bir katyon olabilir. Kalsiyum akını P2Y reseptörleri üzerinden katkı ayırt etmek için koşulları 1 mM EDTA veya etilen glikol-bis(β-aminoethyl ether)-N, N, N′, N′-tetraacetic asit (EGTA) K+ orta yerine CaCl2 eklendiği bu içinde kullanılabilir tahlil.

Bu iletişim kuralı da kolayca diğer hücre tipleri uygun şekilde adapte ve diğer iyon kanal reseptörleri veya fagositoz içinde katılmak reseptörleri işlevini soruşturma için yararlı olabilir. Bu yöntem aynı zamanda bir Akış Sitometresi makine ezelî zaman modülü adapte. Örnek olarak, nereye YG boncuk tarafından geleneksel Akış Sitometresi Analizi önce 7-8 dk eklenir fagositoz deneyleri yapılabilir. 37 ° C’de hücreler tutmak ve sürekli olarak onları girdap. Bu gerçek zamanlı bilgi vermez ama ortalama son Floresans farklılıkları hala araştırmacı P2X7 reseptörleri işlevselliği ile ilgili olarak size bilgi verecektir.

P2X7 reseptörleri ilgi olarak bir uyuşturucu hedef21,22 veya23,bir ilaç dağıtım yönlendirmek olarak bile24 hızla büyüyor ve bu esrarengiz reseptör çalışma yöntemleri sürekli olmalı ki uyarlanmış ve üzerine geliştirilmiş Bu çalışmalar kolaylaştırmak. Bu iletişim kuralı yetişkin nöral progenitör hücre işlevinde P2X7 keşfetmek için kullanılabilir yöntemleri özetler ve bu P2X7 reseptör Nörojenik nişler içinde daha büyük bir anlayış elde felç tedavisinde gelişmeler yol açabilir umulmaktadır ve diğer iskemik yaralanma.

Offenlegungen

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Yazarlar, Maria Kasherman ve Xin Huang bu araştırma katkılarından dolayı teşekkür etmek istiyorum. Bu eser Ulusal Sağlık ve tıbbi araştırma Konseyi (NHMRC), Avustralya’da (571100 ve 1048082) ve Baxter yardım Vakfı (M.W., T.C.L. ve M.L. ve T.C.L. için hibe Rebecca L. Cooper tıbbi araştırma Vakfı tarafından desteklenmiştir Sidney, Avustralya). B.G. Avustralya Araştırma Konseyi (ARC) gelecek arkadaş grubu (FT120100581), NHMRC projesi hibe (1048082, 1061419 ve 1120095) ve Victoria Hükümeti’nın operasyonel altyapı desteği hibe Florey Enstitüsü tarafından desteklenmiştir. M.L. bir Charles D. Kelman, MD doktora sonrası Ödülü (2010) Uluslararası retina Araştırma Vakfı (ABD) gelen tarafından desteklenmiştir.

Materials

A438079 Tocris 2972/10
ATP Sigma-Aldrich A2383
AZ10606120 Tocris 3323/10
bzATP Sigma-Aldrich B6396
cytochalasin D Sigma-Aldrich C8273
FACSCalibur Becton Dickinson 
Fluo-8AM AAT-Bioquest 21080 Fluo-4AM and Fura-Red AM have also been used successfully 
Fluoresbrite YG Microspheres  Polysciences Inc 17154-10 1.00 µm, yellow-green
Glutamine ThermoFisher Scientific 25030081 200 mM
HBSS ThermoFisher Scientific 14170112
heparin Sigma-Aldrich H3149
NeuroCult Basal Medium Stemcell Technologies 5700 Mouse and rat
NeuroCult Proliferation Supplement Stemcell Technologies 5701 Mouse and rat
oxidized ATP Sigma-Aldrich A6779
Pluronic F-127 Sigma-Aldrich P2443 pluronic acid
Recombinant Murine EGF Peprotech 315-09
Recombinant Murine FGF-basic Peprotech 450-33
tetramethylammonium hydroxide Sigma-Aldrich T7505
Time Zero Module Cytek Biosciences
Tissue culture flasks BD Falcon (Corning) 353108 (T25), 353136 (T75) Blue vented screw cap
TrypLE Express Gibco 12604013
Trypsin-EDTA (0.25%) ThermoFisher Scientific 25200056 with phenol red
UltraPure Ethidium Bromide ThermoFisher Scientific 15585011 10 mg/mL
DOWNLOAD MATERIALS LIST

Referenzen

  1. Sperlagh, B., Illes, P. P2X7 receptor: an emerging target in central nervous system diseases. Trends in Pharmacological Sciences. 35 (10), 537-547 (2014).
  2. Liang, X., et al. Quantifying Ca2+ current and permeability in ATP-gated P2X7 receptors. Journal of Biological Chemistry. 290 (12), 7930-7942 (2015).
  3. Rat, P., Olivier, E., Tanter, C., Wakx, A., Dutot, M. A fast and reproducible cell- and 96-well plate-based method for the evaluation of P2X7 receptor activation using YO-PRO-1 fluorescent dye. Journal of Biological Methods. 4 (1), 64 (2017).
  4. Gu, B. J., et al. A quantitative method for measuring innate phagocytosis by human monocytes using real-time flow cytometry. Journal of Quantitative Cell Science: Cytometry Part A. 85 (4), 313-321 (2014).
  5. Jursik, C., et al. A quantitative method for routine measurement of cell surface P2X7 receptor function in leucocyte subsets by two-colour time-resolved flow cytometry. Journal of Immunological Methods. 325 (1-2), 67-77 (2007).
  6. Surprenant, A., Rassendren, F., Kawashima, E., North, R. A., Buell, G. The cytolytic P2Z receptor for extracellular ATP identified as a P2X receptor (P2X7). Science. 272 (5262), 735-738 (1996).
  7. Delarasse, C., et al. Neural progenitor cell death is induced by extracellular ATP via ligation of P2X7 receptor. Journal of Neurochemistry. 109 (3), 846-857 (2009).
  8. North, R. A. Molecular physiology of P2X receptors. Physiological Reviews. 82 (4), 1013-1067 (2002).
  9. Leeson, H. C., et al. P2X7 Receptors Regulate Phagocytosis and Proliferation in Adult Hippocampal and SVZ Neural Progenitor Cells: Implications for Inflammation in Neurogenesis. Stem Cells. , (2018).
  10. Glaser, T., et al. Modulation of mouse embryonic stem cell proliferation and neural differentiation by the P2X7 receptor. PLoS One. 9 (5), e96281 (2014).
  11. Papp, L., Vizi, E. S., Sperlagh, B. Lack of ATP-evoked GABA and glutamate release in the hippocampus of P2X7 receptor-/- mice. Neuroreport. 15 (15), 2387-2391 (2004).
  12. Wiley, J. S., Gu, B. J. A new role for the P2X7 receptor: a scavenger receptor for bacteria and apoptotic cells in the absence of serum and extracellular ATP. Purinergic Signalling. 8 (3), 579-586 (2012).
  13. Lovelace, M. D., et al. P2X7 receptors mediate innate phagocytosis by human neural precursor cells and neuroblasts. Stem Cells. 33 (2), 526-541 (2015).
  14. Walker, T. L., Kempermann, G. One mouse, two cultures: isolation and culture of adult neural stem cells from the two neurogenic zones of individual mice. Journal of Visualized Experiments. (84), e51225 (2014).
  15. Babu, H., et al. A protocol for isolation and enriched monolayer cultivation of neural precursor cells from mouse dentate gyrus. Frontiers in Neuroscience. 5, 89 (2011).
  16. Gu, B. J., Wiley, J. S. Broad applications of mulit-colour time-resolved flow cytometry. Flow Cytometry – Recent Perspectives. , (2012).
  17. Cheewatrakoolpong, B., Gilchrest, H., Anthes, J. C., Greenfeder, S. Identification and characterization of splice variants of the human P2X7 ATP channel. Biochemical and Biophysical Research Communications. 332 (1), 17-27 (2005).
  18. Gu, B. J., Saunders, B. M., Jursik, C., Wiley, J. S. The P2X7-nonmuscle myosin membrane complex regulates phagocytosis of nonopsonized particles and bacteria by a pathway attenuated by extracellular ATP. Blood. 115 (8), 1621-1631 (2010).
  19. Gu, B. J., Rathsam, C., Stokes, L., McGeachie, A. B., Wiley, J. S. Extracellular ATP dissociates nonmuscle myosin from P2X(7) complex: this dissociation regulates P2X(7) pore formation. American Journal of Physiology-Cell Physiology. 297 (2), C430-C439 (2009).
  20. Gu, B. J., et al. P2X7 receptor-mediated scavenger activity of mononuclear phagocytes toward non-opsonized particles and apoptotic cells is inhibited by serum glycoproteins but remains active in cerebrospinal fluid. Journal of Biological Chemistry. 287 (21), 17318-17330 (2012).
  21. Bhattacharya, A. Recent Advances in CNS P2X7 Physiology and Pharmacology: Focus on Neuropsychiatric Disorders. Frontiers in Pharmacology. 9 (30), (2018).
  22. Burnstock, G., Knight, G. E. The potential of P2X7 receptors as a therapeutic target, including inflammation and tumour progression. Purinergic Signalling. 14 (1), 1-18 (2018).
  23. Alves, L. A., et al. Pore forming channels as a drug delivery system for photodynamic therapy in cancer associated with nanoscintillators. Oncotarget. 9 (38), 25342-25354 (2018).
  24. Pacheco, P. A., et al. P2X7 receptor as a novel drug delivery system to increase the entrance of hydrophilic drugs into cells during photodynamic therapy. Journal of Bioenergetics and Biomembranes. 48 (4), 397-411 (2016).

Tags

Real-time Live-cell Flow CytometryCalcium InfluxPore FormationPhagocytosisP2X7 ReceptorsNeural Progenitor CellsSubventricular ZoneHippocampusNeurospheresCell CultureCalcium Indicator DyeCalcium-free Sodium MediumPotassium Medium

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Diesen Artikel zitieren
Leeson, H. C., Chan-Ling, T., Lovelace, M. D., Brownlie, J. D., Weible II, M. W., Gu, B. J. Real-time Live-cell Flow Cytometry to Investigate Calcium Influx, Pore Formation, and Phagocytosis by P2X7 Receptors in Adult Neural Progenitor Cells. J. Vis. Exp. (146), e59313, doi:10.3791/59313 (2019).
Zitat herunterladen
Nachdrucke und Berechtigungen

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image