칼슘 유입, 기 공 형성 및 성숙한 신경 조상 세포 수용 체 P2X7에 의해 식 균 작용을 조사 하기 위해 실시간 라이브 셀 Cytometry

동물 과학적 목적에 대 한 관심과 동물의 사용에 대 한 호주 코드 연습에 따라 처리 하 고 그리피스 대학 동물 윤리 위원회에 의해 사용을 위해 승인 되었다. 1. Neurosphere 문화 성인 SVZ와 해 마의 신경 조상 세포의 참고: 여기 해 부 프로토콜 기반 작업 워커와 Kempermann, 그리고 성인 쥐에서 신경 조상 세포의 해 부에 대 한 자세한 프로토콜은 다른 곳에서 사용할 수14. 문화 조건 간디와 동료15에서 수정 되었습니다. 8-12 주 세 성인 여성 C57BL/6 마우스 사용 되었다. 생물 안전 캐비닛, 준비와 신경 줄기 세포 확산 보충, 2mm 글루타민, 20 ng/mL 표 피 성장 인자 (EGF), 10 ng/mL 기본적인 섬유 아 세포 성장 인자 (bFGF), 2 µ g/mL 보충 문화 매체 (신경 기저 매체) 헤 파 린입니다. CO2 흡입에 의해 두 마우스를 안락사. 또는 기관의 지침에 따라 마우스를 anesthetize 하 고 즉시 자 궁 경부 전위에 의해 안락사. 70% 에탄올과 그들의 머리를 스프레이 하 고 그들을 목을 벨. 1 x 페니실린/스 솔루션 (P/S)와 포함 하는 행 크의 균형된 소금물 (HBSS) 무 균 튜브에 각 머리를 전송. 해 부 현미경 아래 층 류 두건에 해를 수행 합니다. 집게 및 해 부가 위를 사용 하 여 조직과 뼈 노출은 뇌를 제거 하 고 HBSS P/미와를 포함 하는 메 마른 요리에 그것을 전송합니다 뇌 복 부 측을 놓고 메스 블레이드를 사용 하 여 광학 chiasm에 걸쳐 완전 한 코로나 절 개를 하 게 합니다. 집게와 꾸준한 두뇌를 보유 하 고 사용 하나 스위프트, 깨끗 한, 하강 운동. 세포 죽음을 최소화 하 고 조직 구조를 유지 하기 위해 톱 질 하지 마십시오.참고: 안전 하 게 지지, 두뇌 앞으로 기울 수 컷, 동안에 SVZ에서 얻은 조상 세포의 수를 손상 시 키 지. 두뇌의 rostral 절반에서 SVZ를 격리 합니다. 두 심을, 그들 위에 흰색 다리를 형성 하는 신체 callosum, 심장으로 구분을 찾습니다. 집게를 사용 하 여 두 심 분리 심장 제거 하 고 앞쪽 측면 심의 측면 벽을 격리. 이렇게 멀리 위, 아래, 측면, 그리고 앞에 잘 해 부가 위 절단 합니다. 그냥 작은 컵 같은 모양이 유지 됩니다. HBSS는 중간에 몇 방울으로 깨끗 한 Petri 접시 뚜껑을 준비 하 고 액체에는 SVZ를 전송. 건조 하거나 마른 표면을 조직을 허용 하지 않습니다. 고 된 해 부 동안 옆에 서 있다. 두뇌의 꼬리 반에서 된 격리 합니다. 중간 절단 신체 callosum에 반구 사이 컷을 확인 합니다. 측면 심 가이드로 사용 하 고 노출 해 마 피를 부드럽게 전개. 일단 피 질 압 연 하고있다, 해 마는 조밀 하 고, 백색, 곡선 구조로 볼 수 있습니다. 잘 해 부가 위 또는 집게를 사용 하 여 인접 조직에서 해 마를 분리. 집게와 초과 백색 질, 혈관, 및 해 마를 덮고 어떤 막 조직을 제거 합니다. 깨끗 한 Petri 접시 뚜껑 HBSS의 몇 방울과 함께 준비를 준비 하 고 액체에는 해 마를 전송. 다른 반구에 대 한 반복 합니다. 해 마와 두 개의 마우스에서 SVZ 절연 되었고 그들의 각각 샬레 뚜껑을 전송, 일단 기계적 조직 메스 블레이드를 사용 하 여 주사위. 약 1 분 동안 한 Petri 접시 뚜껑에 조직을 잘라, 회전 마다 10 s 조직 부드러운 때까지 및 정밀한 조각만 남아 있다. 깨끗 한 메스 블레이드를 걸릴 고 다른 접시, 1 분 동안 조직 다이 싱에 대 한 반복 합니다. 1 mL 피 펫을 사용 하 여 0.25% trypsin ethylenediaminetetraacetic 산 (EDTA)의 1 mL를 포함 하는 튜브를 분리 하 각 페 트리 접시의 뚜껑에서 모든 조직 전송. SVZ와 해 마에 대 한 1 개의 관에 대 한 하나의 튜브를 사용 합니다. 이렇게 첫 번째 pipetting 기포를 최소화 하 고 튜브를 전송으로 건조 피 펫 팁의 접촉으로 오는 조직 방지 하기 위해 접시에 조직에 트립 신-EDTA의 절반 합니다. 접시와 수집 가능한 많은 조직 관에 그것을 추가 하는 트립 신-EDTA의 나머지와 함께 메스 칼 린스. 30 분, 제대로 조직 분리를 튜브 마다 10 분 교 반에 대 한 37 ° C 물 욕조에 트립 신으로 조직 품 어. 단일 세포 현 탁 액을 화재 광택 유리 파스퇴르 피 펫을 사용 하 여 조직 triturate 알아서 하지 overtriturate이 과도 한 세포 세포의 용 해를 일으킬 것입니다. 이것은 최적의 조직 분리에 대 한 중요 한 단계 이다. 분쇄 과정에서 튜브 내용을 관찰 하 고 조직 덩어리의 대부분 제거 된 초기 징후에 중지. 트립 신 솔루션 해야 될 약간 흐린 셀 단일 셀 서 스 펜 션에 갔을 때 비록 일부 대단히 짧은 시간에 남아 있을 수 있습니다.참고: 표시로 전달 10 x-15 x 위아래로 정지 적절 한입니다. 문화 매체 추가 중화 하는 트립 신, 고 추가 3 분 세척에 대 한 300 x g 에서 회전까지 5 mL HBSS와 패스 2 x 70 µ m 셀 거르는 어떤 조직을 제거를 통해 매체 묶습니다. T75 셀 문화 플라스 크에 매체의 15 mL의 모든 셀을 전송 합니다.참고: 제로 (P0) 통로에서 형성 한다 구체 SVZ 문화 그리고 hippocampal 문화에서 15-20 일 후 7-10 일 후. 세척 또는 문화에 있는 신경 조상 세포의 수를 최대화 하려면이 시간 동안 세포를 먹이 기에서 후 렴. 더 많은 창시자는 필요, 또는 경우 P0 보육 시간 감소, 그것은 희생 하는 쥐의 수를 늘릴 수 있습니다. 37 ° C와 5% CO2 , 초기 P0 문화 단계에서 문화를 유지, 생물 안전 캐비닛 및 표준 조직 문화 사례를 사용 하 여 필요에 따라 모든 7-10 일 통행.참고: P0 hippocampal 문화 T25 플라스 크;에 통로에 충분 한 분야를 생성 한다 SVZ 문화 많은 더 많은 분야 생성 되 고는 T75에 passaged 수 있습니다. P0 hippocampal 분야는 준수 하는 경우 200 µ L 피 펫을 사용 하 여 영역을 부드럽게 리프트. 그들은 150 ~ 200 µ m 직경에 도달 했을 때 구체 통로. 분야와 매체 15 mL 튜브에 수집 하 고 약 5 분 또는 중력에 의해 정착, 2 분 동안 저속 (100 x g)에 스핀을 구체 허용. 매체를 제거 하 고 분리 시 약 분야의 크기에 따라 7-10 분에 대 한 셀을 분리.참고: 분리 시 약 사용 그래서 문화권의 결과에 상당한 영향을 있을 것 이다 구체적인 테이블의 자료 를 참조 하십시오. 세척 셀 솔루션을 위해 3 분 300 x g 에서 원심 분리기 HBSS의 5 mL을 추가 하 여 셀 제거는 상쾌한, 문화 매체에 셀 resuspend 및 T25 세포 배양 플라스 크 또는 이와 동등한 매체의 5 mL에 약 150000 셀에서 씨앗. 37 ° C, 5% CO2에서 문화를 유지 합니다. 모든 다운스트림 프로토콜9를 진행 하기 전에 줄기 세포 마커 Sox2, ASCL1 등의 식 식별 하 여 신경 조상 세포 상태를 확인 합니다.참고: 이 연구원의 선호 되는 방법 (예를 들어,: immunochemistry 현미경 검사 법, cytometry 또는 서쪽 오 점 또는 정량적 중 합 효소 연쇄 반응 (정량)를 사용 하 여)에 의해 행 해질 수 있다. 2. Cytometry 분석에 대 한 단일 세포 현 탁 액의 준비 필요한 미디어를 준비 합니다. 다음 포함 됩니다. 145 mM NaCl, 5mm 코, 10 mM HEPES, 5mm D-포도 당, 0.1% 소 혈 청 알 부 민 (BSA), 그리고 0.1 m m CaCl2 나+ 매체 를 준비 합니다. 이 매체는 칼슘 무료 양식, 0.1 m m CaCl2 생략에 사용 됩니다. K+ 매체 145 m m KCl, 5mm 코, 10 mM HEPES, 5mm D-포도 당, 그리고 0.1 %BSA 준비 합니다.참고: 이러한 미디어 최적화 광범위 하 게 했다 고 이전 간행물4,5에 자세히 나와 있습니다. 100 m m 재고의 약 20 mL에 대 한 충분 한 ATP 분말 무게 재고 ATP 를 준비 합니다. KCl 버퍼 (145 m KCl m, 5 m m 코, 그리고 10 mM HEPES, pH 7.5)의 17 mL에 분말 고 천천히, 교 반, 동안 pH 6.8-7.0가지고 솔루션을 18% (w/v) 하거나 수산화 (TMA)의 2 개 mL를 추가 합니다. 20 mL를 최종 볼륨을 조정 합니다. PH 7.0 과거 오버 슈트 하지 마십시오. 재고-80 ° C에서 저장 참고 최소 6 개월에 대 한 ATP aliquots는 안정.참고: 무수 ATP의 무료 분자량은 551.14 g/mol, 그리고 배치에서 배치에 따라 달라질 수 있습니다 고 계산에 대 한 고려 사항으로가지고 야 한다 물과 disodium 분자의 분자량은 포함 되지 않습니다. TMA은 독성, 그리고 주의 해야 합니다 처리 하는 경우. 안전 데이터 시트와 연기 캐비닛에 주식 준비를 읽어 보시기 바랍니다. 주식 BzATP 초순 H2O 10 m m의 마지막 재고 농도 대 한 BzATP을 용 해 하 여 준비 합니다. 1.16-1.17 단계에 설명 된 대로 단일 세포 현 탁 액을 만듭니다. Hemocytometer 또는 자동 셀 카운터를 사용 하 여 셀을 계산 합니다. (아래와 같이) 실시 되는 실험에 대 한 필요한 매체 (예를들면, Na+ 매체, 문화 매체)에 셀 resuspend 하 고 반면에 얼음에 셀을 놓습니다. 각 실험에 대 한 충분 한 샘플 전압 및 보상 설정의 교정 뿐만 아니라 앞으로 및 측면 분산형, 컨트롤을 포함 하는 확인 합니다. Note, 표시, T75 플라스 크에서 일반적으로 성장 하는 분야 플라스 크 당 약 8 x 106 세포 생성. 교류 cytometer 설정을 컨트롤 샘플을 사용 하 여 설정 합니다. 앞으로 및 측면 분산형을 사용 하 여 선택적으로 살아있는 세포를 게이트.참고: 앞으로 분산형 측면 분산형 내부 복잡성 또는 세분성의 측정값을 제공 한다 빛의 회절에 따라 셀 크기에 관한 정보를 제공 합니다. 스몰 포워드와 사이드 분산형 흐름 이벤트 죽은 세포로 간주 될 수 있습니다. 전압을 조정 하 고 제조업체의 지침에 따라 교류 cytometer의 이득. 최대 형광 강도에서 데이터의 캡처 수 있도록 시험 샘플을 실행 합니다. 보상은 단일 채널 인수에 대 한 필요 합니다. 3. 라이브 셀 흐름 Cytometry 칼슘 유입 측정 단일 셀 서 스 펜 션의 준비에 따라 칼슘 무료 나+ 매체의 1 mL에 셀 resuspend 및 제조업체의 프로토콜에 따라 칼슘 지시자 염료의 2 ng/mL와 함께 그들을 로드 ( 테이블의 자료를 참조)와 10 µ L 5 %pluronic 산. 37 ° c.에 30 분에 대 한 셀을 품 어 세포 칼슘 무료 나+ 매체의 3-5 mL을 추가 하 고 부드럽게 centrifuging 여 세척 (200 x g 4 분). 상쾌한을 제거 하 고 두 번 세척 칼슘 무료 나+ 매체에 셀 resuspend. Resuspend 칼슘 무료 나+ 매체의 1 mL에 셀, 얼음에 고 드 30 분 esterify 하도록 허용. 1 x K+ 매체의 3-5 mL을 추가 하 고 (200 x g 4 분); centrifuging 여 더 씻으십시오 그런 다음 resuspend k+ 매체 및 aliquot 셀 그들 (FACS) 정렬 보조 셀 튜브 FACS 튜브 당 500 µ L 당 1 x 106 세포의 농도에 형광으로.참고: FACS 튜브 샘플 당 수 치료의 수에 따라 달라 집니다 고는 포함을 반복 합니다. 셀 분석할 준비가 될 때까지 얼음에 FACS 튜브를 놓습니다. 오랜된 기간 동안 얼음에 셀 떠나 지 마 하지만 분석 결과 최대한 빨리 시작. 일부 샘플에 대 한 preincubate P2X7 수용 체 특정 억제제 AZ10606120 셀 (1 µ M 10-15 분) 또는 A438079 (30 분 10 µ M) 분석 이전 37 ° C에서. 첫 번째 샘플을 실행 하기 전에 몇 분 (FACS 튜브에 1 mM의 최종 농도)에 CaCl2 를 추가 하 고 복구 하는 37 ° C 물 목욕에서 튜브를 놓습니다. 깨끗 한 삭제, FACS 튜브 및 위치에 작은 자력 제어 샘플 온도 순환 37 ° C 물 목욕 시간 모듈에 튜브 연결. 소용돌이 효과 도입 하지 않고 샘플의 움직임을 보장 하기 위해 낮은 교 반 속도 선택 합니다. 물 재킷 튜브 어댑터 샘플 플랫폼에 놓고 FACS 기계의 레버 팔을 닫습니다. 샘플 수집을 시작 하 고 초당 약 1000 이벤트에서 3 분에 대 한 샘플을 실행 합니다. 40 s 마크, 신속 하 게 튜브를 제거 하 고 추가 P2X7 주 작동 근, ATP 1 mM 또는 300 µ M BzATP, 인수를 계속 해 서 튜브를 교체 하 고. 첫 번째 샘플을 녹음 하는 동안 CaCl2 두 번째 샘플을 준비 하 고 분석 하기 전에 워밍업을 셀에 대 한 충분 한 시간을 허용 하도록 37 ° C에. 첫 번째 샘플 완료 되 면, 물 샘플을 실행 하 여 섭취를 청소 하 고 두 번째 샘플의 수집 단계 3.8 및 3.9에에서 설명 된 대로 시작할 수 있습니다. 항상 샘플 사이 섭취 청소. 4. 측정 라이브 셀 Cytometry에 의해 기 공 형성 1.16-1.17 단계에 설명 된 대로 단일 세포 현 탁 액을 만듭니다. 오래 된 매체의 몇 밀리 리터를 저장 하 고 resuspend FACS 튜브 당 100 µ L 당 1 x 106 세포의 농도에서 세포를 그것을 사용 하 여 준비까지 얼음에 그것을 배치. 분석 결과 실행 하기 전에 1 mL의 최종 볼륨에 대 한 K+ 매체의 900 µ L을 추가 하 고 복구를 10 분 동안 37 ° C 물 욕조에 튜브를 배치 합니다. 해당 되는 경우 치료, P2X7 전용 억제제 AZ10606120를 포함 하 여 셀 preincubate (10-15 분 1 µ M) 또는 A438079 (30 분 10 µ M). 분석 결과 실행 하기 전에 즉시 추가 25 µ M ethidium 평범한 사람 FACS 튜브; 그런 다음, 자력, 추가 단계 3.7에 따라 FACS 기계에 그것을 배치 하 고 인수를 시작.참고: Ethidium 평범한 사람은 독성, 그리고 주의 해야 한다 그것을 처리 하는 경우. FACS 튜브 사용된 적절 하 게 폐기 합니다. 세포 막에 있는 숨 구멍의 대형을 유도 하는 수집의 시작 후 1mm ATP 또는 100 µ M BzATP 40 s를 추가 합니다. 6 분 동안 초당 약 1000 이벤트에서 샘플을 실행 합니다. 첫 번째 샘플을 실행 하는 동안 두 번째 샘플은 얼음에서 고 37 ° C 물 목욕 분석 전 복구 하 셀에 대 한 충분 한 시간을. 첫 번째 예제는 인수 완료 되 면, 물 샘플;를 실행 하 여 섭취를 청소 그런 다음, 두 번째 샘플 단계 3.8 및 3.9에에서 설명 된 대로 녹음을 하려면 컴퓨터에 배치할 수 있습니다. 5. 측정 라이브 셀 Cytometry에 의해 식 균 작용 1.16-1.17 단계에 설명 된 대로 단일 세포 현 탁 액을 만듭니다. 조건된 중에 FACS에 FACS 튜브 당 100 µ L 당 1 x 10 이상6 셀의 농도에 관 약 수 셀 resuspend 1 x 106 셀/mL 나+ 매체의 최종 농도에 세포를 희석 (예를 들어, 추가 나+ 매체의 900 µ L) 분석 수행 될 때까지 얼음에 셀을 놓습니다. Phagocytic 대상으로 YG 라텍스 구슬 (스피어)의 1 개의 µ m를 사용 하 여 실시간 먹어서 분석 실험에 대 한.참고: 다른 색상도 대체 될 수 있습니다, 하지만 다르게 크기의 구슬을 먹어서4의 부적당 한 표적이 될 것을 발견 했다. 첫 번째 예제를 실행 하기 전에 셀 37 ° C 물 목욕을 전송 하 고 복구를 셀 수 있도록 약 7-10 분 동안 그들을 품 어. 1mm ATP 15 분을 포함 하 여 그들의 각각 튜브에 preincubation를 요구 하는 어떤 처리 든 지 추가, 300 µ M 산화 ATP (oxATP) 40 분, 20 분 및 20 분 동안 4 %paraformaldehyde (PFA) 20 µ M cytochalasin D. 아무 preincubation는 5% 인간 혈 청에 대 한 필요 합니다. 치료 약 동시에 추가 하는 경우 샘플 실행할 수 있습니다 반대 순서로 다른 사람 품 어를 계속 하는 동안. 예를 들어 실행 컨트롤 및 혈 청 먼저, 다음 ATP 치료 샘플, cytochalasin D와 PFA, 그리고 oxATP 마지막 다음. 샘플에는 자력으로 cytometer 3.8 및 3.9 단계에 설명 된 대로 놓고, 다음, 샘플 수집을 시작 합니다. 제거 샘플 튜브는 기계에서 15-20의 수집, 시작 후 고 undiluted YG 구슬의 5 µ L를 추가 합니다. 샘플 FACS 튜브를 반환 하 고 인수를 계속 합니다. 약 1000 이벤트/s에서 7-8 분에 대 한 샘플을 실행 합니다. 첫 번째 샘플을 실행 하는 동안 두 번째 샘플은 얼음에서 고 분석 전 복구 하 셀에 대 한 충분 한 시간을 허용 하는 37 ° C 물 목욕에. 첫 번째 샘플 완료 되 면 섭취 물 샘플을 실행 하 여 깨끗 하 고, 다음, 두 번째 샘플에 수집을 시작 하는 단계 3.8 및 3.9에에서 설명 된 대로. 6. 데이터 분석 스프레드시트 데이터를 내보냅니다. 데이터 분석 실험 질문에 따라 달라 집니다.참고: 주의 시작에 지정 된 시간에 대 한 분석 결과 실행 하는 것이 중요 하다 그래서 다른 실행 다른 초기 농도을 할 수 있습니다 (약 40 s) 형광 (형광 변화를 계산 하 여 데이터를 정규화 하 고 어떤 촉진제를 추가 하기 전에 주어진 시간 포인트 [F] 형광 시간 포인트 0에서 [F0], 또는 F/F0 나눈에). 계량 속도 또는 P2X7 함수에의 활동, 곡선 또는 곡선 각 10 s 시간 기간16에서 사다리꼴의 합계 아래 영역을 계산 합니다. 치료의 효과 확인 하려면 기록의 마지막 10-20 s 형광 강도 평균 고 치료 됩니다. T의미 확인-테스트 또는 분산 분석.