Na differentiatie Herbeplating van menselijke pluripotente stamcel afkomstige neuronen voor het screenen van hoge inhoud van Neuritogenese en Synapse rijping

Menselijke pluripotente stamcel (hiPSC)-afgeleide neuronen worden steeds relevanter op het gebied van fundamenteel onderzoek, Geneesmiddelenontwikkeling en regeneratieve geneeskunde. Workflows en procedures om hun cultuur en onderhoud te optimaliseren en de efficiëntie van differentiatie in specifieke neuronale subtypen te verbeteren, evolueren snel^1,2. Om het nut en de kosteneffectiviteit van menselijke stamcel afkomstige neuronen te verbeteren als modelsystemen die vatbaar zijn voor analyses met een hoog gehalte in geneesmiddelen ontdekking en doel validatie, is het nuttig om de kweektijd te verlagen die nodig is voor het genereren van volwassen, functionele neuronen, met behoud van maximale robuustheid, reproduceerbaarheid en fenotype relevantie. Hoewel 3-dimensionale organoïde-culturen doorbraken in neuroontwikkelingsonderzoek rijden, zijn 2-dimensionale monolaag-culturen met name compatibel met geautomatiseerde beeldvormings toepassingen vanwege hun minimale weefsel dikte.

Echter, de aanpassing van Imaging-gebaseerde screeningmethoden aan modellen van menselijke neurologische en neuroontwikkelingsziekte wordt geconfronteerd met een grote uitdaging. Het langdurige tijdsbestek waarover het menselijk zenuwstelsel in vivo rijpt, vereist uitgebreide tijd in cultuur om tegemoet te komen aan natuurlijke Programma’s van genexpressie en neuronale rijping te bereiken.

Een praktisch gevolg van het lange neuronale differentiatie programma is dat het onderhoud van de met hipsc afgeleide monolaag culturen gedurende vele weken moet worden gehandhaafd om een adequate Synapse maturiteit te bereiken. Gedurende deze tijd, neurale voor ouders die ongedifferentieerde blijven blijven verdelen. Deze kunnen de cultuur snel overgroeien en de nutriënten-inhoud die nodig is om levensvatbare postmitotische neuronen te behouden. Krachtig verdelen neurale voorlopercellen (Npc’s) kan ook concurreren met neuronen voor de groei substraat. Hierdoor kunnen dergelijke culturen worden onderworpen aan problemen met een slechte hechting, een aandoening die ongeschikt is voor op beeldvorming gebaseerde assays. Bovendien vinden veel onderzoekers dat hoe kleiner het cultuur volume, hoe groter de moeilijkheid bij het handhaven van gezonde populaties van gedifferentieerde neuronen lang genoeg om de late stadia van neuronale differentiatie te observeren. Met andere woorden, assays van Synapse rijping met behulp van High content screening (HCS) benaderingen kunnen zeer uitdagend voor menselijke-afgeleide neuronen.

Om sommige van deze problemen te omzeilen, is een procedure voor het opnieuw opschorten en replating van eerder gedifferentieerde hiPSC-afgeleide neuronen gebruikt. Ten eerste, het maakt de studie van neuriet uitgroei (of, nauwkeuriger, neuriet regeneratie) in een populatie van volledig betrokken neuronen. Ten tweede, de herbeplating van eerder gedifferentieerde neuronen uit een groot volume formaat (zoals 10 cm platen of groter), tot kleine volume formaten (zoals HCS-compatibele 96-of 384-well microtiterplaten) maakt een significante reductie in de totale kweektijd in de kleine volume conditie. Dit vergemakkelijkt de studie van Synapse assemblage en rijping in de daaropvolgende weken in vitro.

Echter, de replating van volwassen neuronen die al hebben vastgesteld lange neurites en een complex connectiviteits netwerk presenteert verschillende uitdagingen, waarvan één is de soms hoge en variabele snelheid van celdood. Hier beschrijven we een replating procedure die resulteert in uitstekende celoverleving en reproduceerbaarheid. Gewoonlijk worden neuronen blootgesteld aan Proteolytische enzymen voor korte incubatie perioden (meestal ~ 3-10 min) om cellen los te maken van het substraat voorafgaand aan de trituratie. Deze korte proteolyse tijd wordt gewoonlijk gebruikt voor het resuspenderen en doorvoeren van vele soorten scheidings cellen, waaronder niet-neuronale cellen en ongedifferentieerde voor ouders^4,5,6. Echter, voor gedifferentieerde neuronen met lange, onderling verbonden neurites, is het essentieel niet alleen om cellen los te koppelen van het substraat, maar ook om het dendritische en axonale netwerk te verstoren om individuele cellen te isoleren terwijl de schade wordt geminimaliseerd. Inderdaad, een dik gevlochten van neuronen meestal de neiging om los te koppelen van het substraat als een enkel blad, in plaats van als individuele cellen. Als er geen zorg wordt genomen om het dikke netwerk van neurites los te maken, worden neuronen niet alleen onomkeerbaar beschadigd tijdens de trituratie, maar velen van hen verzuimen het filter te passeren dat wordt gebruikt om klonten te verwijderen, wat resulteert in een slechte celopbrengst. Hieronder beschrijven we een eenvoudige wijziging van een veelgebruikte incubatie procedure voor protease om deze moeilijkheden tegen te gaan.

In het hieronder beschreven protocol worden neuronen gedurende 40-45 minuten geïnnobeerd met een milde protease, zoals het Proteolytische enzym (bijv. Accutase). Tijdens de eerste 5-10 min na het toevoegen van het enzym, het neuronale netwerk Tilt van de ondergrond als een blad. De incubatie met de protease gaat nog 30-40 minuten mee voordat de zachte trituratie en filtering wordt voortgezet. Deze extra incubatietijd zorgt ervoor dat de vertering van het materiaal het intercellulaire netwerk ontspant, zodat de daaropvolgende trituratie een suspensie van individuele cellen oplevert. Deze procedure maximaliseert de uniformiteit van de celverdeling bij het replating, terwijl de celdood wordt geminimaliseerd. We hebben deze replating methode met succes toegepast op door hipsc afgeleide neuronale culturen, gegenereerd door verschillende differentiatie protocollen^7,8 en verschillende lijnen van hipscs. De procedure is nominaal geschikt voor gebruik met de meeste of alle lijnen van stamcel afgeleide neuronen. We hebben geconstateerd dat een verlengde incubatietijd van de protease niet absoluut noodzakelijk is voor het replating van culturen uit kleine formaat platen (bijv. 35 mm diameter); echter, zoals we hier laten zien, biedt het een significant voordeel bij het replating van platen met grote diameter (bijv. 10 cm diameter of groter), waarschijnlijk omdat neurites in dergelijke platen zeer lange processen kunnen verlengen en een dicht met elkaar verbonden array vormen.

Hier demonstreren we deze methode en illustreren kort de toepassing ervan in assays voor vroege neuritogenesis en voor Synapse rijping, waarbij clustering van pre-en postsynaptisch eiwitten langs de dendrieten en axonen, gevolgd door hun latere colokalisatie op synaptische sites. De voorbeelden wijzen op de voordelen die dit protocol biedt bij het behoud van de levensvatbaarheid en reproduceerbaarheid van cellen. Ten eerste staat het onderzoekers toe om vroege stappen in menselijke neuritogenese te bestuderen. De experimentele instelling is vergelijkbaar met de veelgebruikte primaire culturen van knaagdieren corticale of hippocampal neuronen, waar cellen worden geëxtraheerd uit de late foetale of vroege postnatale hersenen, gezien door trituratie na milde protease behandeling, en toegestaan om te initieert neurites of regenereren neurites die in de procedure^9,10werden verbroken. Vergelijkbaar met dergelijke knaagdieren primaire neuronen, hiPSC-afgeleide neuronen beginnen te vormen of hun neurites regenereren binnen enkele uren na het replating, waardoor Imaging van groei kegels en neuriet morfologie in een omgeving die optimaal is voor hoge spatiotemporele beeldvorming met minder Omringende ongedifferentieerde cellen. We hebben geconstateerd dat neuriet uitgroei is meer gesynchroniseerd in vergelijking met de variabele vertragingen en verschillende uitgroei percentages gezien wanneer neuronen beginnen te onderscheiden van een voorlopercellen populatie. Bovendien, replating maakt assays van neuronen die neuronale subtype markeringen die meestal verschijnen later in neurale ontwikkeling, zoals de corticale laag 5/6 transcriptiefactor CTIP2 (kip ovalbumine upstream Promoter transcriptie factor-interactie eiwit 2), of de pan-neuronale marker NeuN¹¹. Een bijzonder nuttig kenmerk van de replating aanpak is dat synaptogenese verloopt binnen een tijdsbestek compatibel met HCS.