Resposta pós-diferenciação de neurônios derivados de células-tronco pluripotentes humanas para triagem de alto conteúdo de Neuritogênese e maturação de sinapse

Células-tronco pluripotentes humanas (hiPSC)-os neurônios derivados são cada vez mais relevantes nas áreas de pesquisa básica, desenvolvimento de fármacos e medicina regenerativa. Fluxos de trabalho e procedimentos para otimizar sua cultura e manutenção, e melhorar a eficiência da diferenciação em subtipos neuronais específicos, estão evoluindo rapidamente^1,2. Para melhorar a utilidade e a relação custo-eficácia dos neurônios derivados de células-tronco humanas como sistemas modelo que permitem análises de alto conteúdo na descoberta de fármacos e na validação de alvos, é útil diminuir o tempo de cultivo necessário para gerar neurônios, mantendo a máxima robustez, reprodutibilidade e relevância do fenótipo. Embora as culturas organoid 3-dimensionais estejam conduzindo avanços na pesquisa do neurodesenvolvimento³, as culturas do monocamada 2-dimensional são especial compatíveis com as aplicações Imaging-based automatizadas devido a sua espessura mínima do tecido.

No entanto, a adaptação de métodos de triagem baseados em imagem para modelos de doença neurológica e neurodesenvolvimental humana enfrenta um grande desafio. O período prolongado sobre o qual o sistema nervoso humano amadurece in vivo necessita de tempo estendido na cultura para acomodar programas naturais de expressão gênica e alcançar a maturação neuronal.

Uma conseqüência prática do programa longo da diferenciação neuronal é que a manutenção de culturas monocamada hipsc-derivadas deve ser sustentada por muitas semanas para conseguir a maturidade adequada do sinapse. Durante esse tempo, os progenitores neurais que permanecem indiferenciados continuam a se dividir. Estes podem rapidamente overgrow a cultura e usurpar o índice nutriente exigido para manter neurônios células viáveis. A divisão vigorosamente de células progenitoras neurais (NPCs) também pode competir com neurônios para o substrato de crescimento. Isso pode tornar essas culturas sujeitas a problemas de má adesão, uma condição inadequada para ensaios baseados em imagem. Além disso, muitos investigadores acham que quanto menor o volume de cultura, maior a dificuldade em manter populações saudáveis de neurônios diferenciados tempo suficiente para observar os estágios tardios da diferenciação neuronal. Em outras palavras, os ensaios de maturação de sinapse usando abordagens de rastreamento de alto conteúdo (HCS) podem ser muito desafiadores para os neurônios derivados do ser humano.

Para contornar alguns desses problemas, foi utilizado um procedimento de ressuscito e replante de neurônios derivados de hiPSC previamente diferenciados. Em primeiro lugar, permite o estudo do crescimento do neurite (ou, mais precisamente, regeneração de neurite) em uma população de neurônios totalmente comprometidos. Em segundo lugar, a resposta de neurônios previamente diferenciados de um formato de grande volume (como placas de 10 cm ou maior), até formatos de volume pequeno (como placas de de microtitulação 96-ou 384-well compatíveis com HCS) permite uma redução significativa no tempo total de cultivo em a condição de pequeno volume. Isto facilita o estudo do conjunto e da maturação da sinapse sobre semanas subseqüentes in vitro.

No entanto, a resposta de neurônios maduros que já estabeleceram neuritos longos e uma complexa rede de conectividade apresenta vários desafios, um dos quais é a taxa às vezes alta e variável de morte celular. Aqui, nós descrevemos um procedimento de repique que resulte na sobrevivência e na reprodutibilidade excelentes da pilha. Comumente, os neurônios são expostos a enzimas proteolíticas para períodos curtos de incubação (tipicamente ~ 3-10 min), a fim de separar as células do substrato antes da trituração. Este breve tempo de proteólise é habitualmente utilizado para ressuscitar e de muitos tipos de células divisórias, incluindo células não-neuronais e progenitores indiferenciados^4,5,6. No entanto, para neurônios diferenciados que carregam neuritos longos e interligados, é essencial não apenas separar as células do substrato, mas também interromper a rede dendrítica e axonal, a fim de isolar as células individuais, minimizando os danos. Na verdade, uma malha grossa de neurônios geralmente tende a se separar do substrato como uma única folha, em vez de células individuais. Se o cuidado não é tomado para afrouxar a rede grossa de neurites, os neurônios não somente tornam-se irreversivelmente danificados durante o trituration, mas muitos deles não conseguem passar através do filtro usado para remover os grupos, tendo por resultado o rendimento pobre da pilha. Abaixo descrevemos uma simples modificação em um procedimento de incubação de protease amplamente utilizado para contrariar essas dificuldades.

No protocolo descrito abaixo, os neurônios são incubados por 40-45 min com uma protease leve, como a enzima proteolítica (por exemplo, Accutase). Durante o primeiro 5-10 min após a adição da enzima, a rede neuronal levanta-se do substrato como uma folha. A incubação com a protease prossegue por um adicional de 30-40 min antes de prosseguir com trituração e filtração suaves. Este tempo extra da incubação ajuda a assegurar-se de que a digestão do material Relaxe a rede intercelular, assegurando desse modo que o trituration subseqüente produza uma suspensão de pilhas individuais. Este procedimento maximiza a uniformidade da distribuição da pilha em cima de repique ao minimizar a morte da pilha. Nós aplicamos com sucesso este método de repique às culturas neuronal hipsc-derivadas geradas por vários protocolos^7,8 da diferenciação e das várias linhas de hipscs. O procedimento é nominalmente adequado para uso com a maioria ou todas as linhas de neurônios derivados de células-tronco. Observou-se que um tempo prolongado de incubação da protease não é absolutamente essencial para a resposta de culturas de placas de pequeno formato (por exemplo, 35 mm de diâmetro); Entretanto, como nós mostramos aqui, fornece um benefício significativo ao repique das placas do grande diâmetro (por exemplo, diâmetro de 10 cm ou maior), provavelmente porque os neuritos em tais placas podem estender processos muito longos e formar uma disposição densa interconectada.

Aqui nós demonstramos este método e ilustram momentaneamente sua aplicação nos ensaios para o neuritogênese adiantado e para a maturação do sinapse, que envolve o agrupamento de proteínas pre-e pós-sináptica ao longo dos dendritos e dos axônios, seguidos por seu mais atrasado colocalização em sítios sinápticos. Os exemplos destacam as vantagens que este protocolo oferece na preservação da viabilidade celular e reprodutibilidade. Primeiramente, permite que os investigadores estudem etapas adiantadas no neuritogenesis humano. O cenário experimental é semelhante às culturas primárias comumente usadas de neurônios corticais ou hipocampais de roedores, onde as células são extraídas do cérebro pós-natal fetal ou precoce, dissociada pela trituração após tratamento suave da protease, e permitiu Iniciar neuritos ou regenerar neuritos que foram cortados no procedimento^9,10. Semelhante a tais neurônios primários de roedores, neurónios derivados de hiPSC começam a formar ou regenerar seus neuritos dentro de horas após a resposta, permitindo a imagem de cones de crescimento e morfologia neurite em um ambiente ideal para imagens de alta espaciotemporal com menos células não diferenciadas circundantes. Nós observamos que o conseqüência do neurite é mais sincronizado comparado aos atrasos variáveis e às taxas diferentes do conseqüência consideradas quando os neurônios começam primeiramente a diferenciar-se de uma população do progenitor. Além disso, a resposta permite ensaios de neurônios expressando marcadores de subtipo neuronal que tipicamente aparecem mais tarde no desenvolvimento neural, como a camada cortical 5/6 fator de transcrição CTIP2 (frango ovalbumina transcrição promotor upstream fator-interagindo proteína 2), ou o marcador Pan-neuronal NeuN¹¹. Uma característica especialmente útil da abordagem de resposta é que o sinaptogênese prossegue dentro de um período de tempo compatível com HCS.