Medir estabilidad enzimática por calorimetría isoterma de titulación

Las enzimas son proteínas capaces de catalizar una amplia variedad de reacciones orgánicas. Función de más enzimas en solución acuosa a cerca de pH neutro, evitando el uso de solventes agresivos. Debido a su alta selectividad, enzima catalizado reacciones producen menos (en algunos casos ningunos subproductos) subproductos de catalizadores no selectivos tales como ácidos y bases¹. Esto es especialmente relevante en la fabricación de alimentos en todas las reacciones químicas deben hacerse para que el producto final es seguro para el consumo humano. Actualmente, se utilizan enzimas para producir jarabe de maíz de alta fructosa²,³de queso, cerveza⁴, leche sin lactosa⁵y otros productos alimentarios importantes. Aunque este trabajo se centra en el uso de enzimas en la industria de alimentos, hay muchos otros usos para las enzimas incluidas en síntesis química y de la droga verde.

La utilidad de las enzimas es limitada por la estabilidad de la actividad enzimática, que depende del mantenimiento de la estructura tridimensional de la enzima. La estructura de la enzima puede ser estabilizada por modificaciones como pegilación⁶, inmovilización en un soporte sólido⁷modificaciones genéticas⁸y formulaciones. En la actualidad, estabilidad de la enzima por lo general se mide por calorimetría diferencial de barrido (DSC) y ensayos de actividad enzimática de extremo⁹. DSC mide la temperatura a la que se desarrolla una enzima; a mayor temperatura, más estable la estructura. Sin embargo, la pérdida de actividad ocurre a menudo en una temperatura más baja que se requiere para desplegar la enzima o dominios dentro de la enzima¹⁰. Por lo tanto, DSC no es suficiente para determinar si una modificación de la enzima aumenta la estabilidad de la actividad enzimática. Análisis de enzima de extremo son generalmente intensivos en el tiempo, requieren de múltiples muestras y suelen implican una reacción colorimétrica juntada que no es aplicable a soluciones muy coloreadas u opacas o suspensiones.

Este trabajo muestra un método para la medición directa de la estabilidad de la actividad enzimática por calorimetría isoterma de titulación (ITC). CCI mide la tasa de calor liberado o absorbido durante el curso de una reacción. Puesto que casi todas las reacciones producen o absorben calor, ITC puede utilizarse para la mayoría de las reacciones catalizadas por enzima, incluyen reacciones que no tienen una reacción acoplada o se producen en medios opacos como la leche. ITC se ha utilizado por muchas décadas para medir parámetros cinéticos químicos para muchos tipos de reacciones, pero el protocolo que presentamos se centra en el uso de TIC para medir la tasa máxima de calor de las reacciones enzima-catalizadas y demuestra que la actividad enzimática es linealmente correlacionada con la tasa máxima de calor. ITC las medidas de tasas de máximo calor en su mayoría son autónomas y requieren de muy poco tiempo personal para configurar y analizar.