Mesurer la stabilité enzymatique par calorimétrie isotherme de Titration

Les enzymes sont des protéines capables de catalyser un large éventail de réactions organiques. La plupart fonction d’enzymes en solution aqueuse à pH neutre évitant ainsi l’utilisation de solvants agressifs. En raison de leur haute sélectivité, réactions enzymatiques catalysée produisent moins (dans certains ne cas, aucun sous-produits) sous-produits que catalyseurs non sélectifs tels que les acides et les bases¹. Ceci est particulièrement important dans la fabrication d’aliments où toutes les réactions chimiques doivent se faire si le produit final est plus sûr pour la consommation humaine. Actuellement, les enzymes sont utilisés pour produire de sirop de maïs riche en fructose², fromage³,⁴de la bière, lait sans lactose⁵et autres produits alimentaires importants. Bien que cet article se concentre sur l’utilisation des enzymes dans l’industrie alimentaire, il y a beaucoup d’autres utilisations pour les enzymes notamment dans la synthèse verte de chimie et de la drogue.

L’utilité des enzymes est limitée par la stabilité de l’activité enzymatique, qui repose sur le maintien de la structure tridimensionnelle de l’enzyme. La structure de l’enzyme peut être stabilisée par des modifications telles que PEGylation⁶, immobilisation sur un support solide⁷, modifications génétiques⁸et formulations. Actuellement, stabilité de l’enzyme est généralement mesurée par analyse calorimétrique différentielle (DSC) et des analyses de l’activité enzymatique point de terminaison⁹. DSC à mesurer la température à laquelle une enzyme se déploie ; plus la température est élevée, les plus stable de la structure. Toutefois, la perte d’activité se produit souvent à une température plus basse que celle nécessaire pour déplier l’enzyme ou les domaines au sein de l’ enzyme¹⁰. Par conséquent, DSC ne suffit pas à déterminer si une modification de l’enzyme augmente la stabilité de l’activité enzymatique. Essais enzymatiques de point de terminaison sont généralement temps intensif, nécessitent plusieurs échantillons et impliquent souvent une réaction colorimétrique couplée qui n’est pas applicable aux solutions très colorées ou opaques ou de suspensions.

Ce travail démontre une méthode de mesure directe de la stabilité de l’activité enzymatique par calorimétrie isotherme titration (ITC). ITC mesure le taux de chaleur libérée ou absorbée au cours d’une réaction. Étant donné que presque toutes les réactions produisent ou absorbent la chaleur, ITC peut être utilisé pour la plupart des réactions catalysées par les enzymes, incluant des réactions qui ne pas avoir une réaction de couplage ou se produisent dans les milieux opaques tels que le lait. ITC a été utilisé pendant de nombreuses décennies pour mesurer des paramètres cinétiques chimiques pour de nombreux types de réactions, mais le protocole présenté ici se concentre sur l’utilisation de ITC pour mesurer le débit de chaleur du pic des réactions catalysées par les enzymes et démontre que l’activité enzymatique est linéairement en corrélation avec le débit de chaleur maximal. ITC mesures de taux de pic de chaleur sont le plus souvent autonomes et nécessitent très peu de temps personnel pour configurer et analyser.