Imagen intravital longitudinal del comportamiento de las células tumorales cerebrales en respuesta a una biopsia quirúrgica invasiva

Todos los experimentos se llevaron a cabo de acuerdo con las directrices del Comité de Bienestar Animal de la Real Academia neerlandesa de las Artes y las Ciencias, Países Bajos. Los protocolos experimentales utilizados en este manuscrito fueron aprobados por la Centrale Commissie Dierproeven (CCD) y el Instantie voor Dierenwelzijn (IvD). 1. Implantación de células tumorales y preparación de ventanas de imágenes craneales Preparación quirúrgica Use ratones adultos (>6 semanas de edad) de cualquier cepa o género. Sedar un ratón inyectando (fluanisona [neuroléptica] + fentanilo [opioide]) (0,4 ml/kg) + sedante de benzodiazepina (2 mg/kg) a una dosis de 1:1:2 en agua estéril. Evalúe el estado de sedación del animal con pellizco de dedo del dedo del dedo del tiempo.NOTA: En este protocolo, tanto los ratones hembra como los machos C57BL/6 se utilizaron debido al mismo trasfondo genético de la línea celular tumoral utilizada en estos experimentos (GL261). El ratón permanecerá completamente sedado durante 1,5 h. Alternativamente, utilice anestesia por inhalación como isoflurano (1.5%–2% mezcla de isoflurano/O2). Monte el ratón sobre un marco estereotáctico y fije la cabeza con una abrazadera de nariz y dos barras de oído. Utilice una lámpara de calefacción para preservar la temperatura corporal. La lámpara de calefacción debe utilizarse con precaución, alternativamente se pueden utilizar almohadillas de calefacción de recirculación de agua. Aplique un unpomén de ojos para proteger las córneas del ratón del secado. Utilice tijeras afiladas para afeitar el pelaje en el cráneo (área dorsal desde los ojos del ratón hasta la base de su cráneo) y desinfecte la piel expuesta con 70% de etanol. Corta la piel de forma circular con tijeras afiladas y raspa el periosteum debajo con un hisopo de algodón. Aplicar una gota de lidocaína 1% + epinefrina 1:100,000 durante 5 min, y eliminar el exceso con un hisopo de algodón. Pega los bordes de la piel al cráneo con pegamento de cianoacrilato. Coloque el marco estereotáctico bajo un microscopio estéreo de disección con aumento 4x. Visualice el cráneo a través del microscopio de disección y taladre una ranura circular de 5 mm de diámetro sobre el hueso parietal derecho. Realice este paso con cuidado y sólo superficialmente, evitando cualquier presión sobre el cráneo. Aplique una gota de tampón de corteza (125 mM NaCl, 5 mM KCl, 10 mM de glucosa, búfer HEPES de 10 mM, 2 mM MgSO4y 2 mM CaCl2 [pH 7.4]) y levante la solapa ósea con fórceps delgados. Para los siguientes pasos, mantenga la superficie cerebral cubierta con tampón de corteza a menos que se indique lo contrario. Bajo el microscopio de disección, visualice la superficie cerebral y retire la dura mater usando pinzas curvas, cónicas y de punto muy fino. Si se produce sangrado en esta etapa, utilice una esponja de gelatina absorbible para detenerlo. Inyección de células tumorales Resuspenda la cantidad deseada de células tumorales fluorescentes en 3 l de PBS (por ejemplo, para los experimentos mostrados en este protocolo, se inyectaron 1 x 105 células GL261).NOTA: Si bien se puede utilizar cualquier marcador fluorescente, se recomienda encarecidamente un marcador nuclear para rastrear células tumorales individuales durante el análisis. Además, un marcador fluorescente ligado a la histona, como H2B, se puede utilizar para visualizar la condensación cromosómica y, por lo tanto, para monitorear la división celular. El uso de un marcador foto-conmutable, como Dendra2, permite el marcadofotográfico y el seguimiento de las células tumorales durante varios días 4,13. Cargue las células tumorales en una jeringa estanca con 10 ml con una aguja de punto 2 y fíjelas en el brazo del manipulador estereotaxico. Retire el búfer de corteza. Coloque la punta de la jeringa en el centro de la craneotomía e insértela a una profundidad de 0,5 mm de la superficie del cráneo. Opcionalmente, cree un pequeño espacio en el cerebro para acomodar la suspensión de la célula tumoral. Para ello, inserte la jeringa hasta una profundidad de 1 mm y, a continuación, recupere hasta 0,5 mm antes de la inyección. Aplique una gota de búfer de corteza. Inyecte lentamente la suspensión celular con un inyector de bomba de microjeringa (250–400 nL/min). Retire la jeringa y utilice una esponja de gelatina absorbible para detener cualquier sangrado, si es necesario. Preparación de la ventana de imágenes craneales Retire el búfer de corteza y coloque una gota de aceite de silicona en el sitio de craneotomía para evitar burbujas de aire debajo de la ventana. Selle el cerebro expuesto con un cubreobjetos de 6 mm. Aplique pegamento de cianoacrilato entre el cubreobjetos y el cráneo. Presione suavemente el cubreobjetos contra el cráneo con la ayuda de pinzas finas para asegurar una distancia mínima entre el cerebro y la pinza. Aplique cemento acrílico dental en la superficie del cráneo, cubriendo el borde de la cubierta. Coloque un anillo delgado de acero inoxidable (1,5 mm de diámetro exterior, 1 mm de diámetro interior) alrededor de la craneotomía y deje que el cemento dental se seque. Opcionalmente, agregue un poco de pegamento en el borde para asegurar el anillo en la parte superior de la cabeza.NOTA: Este sistema de fijación de la cabeza es óptimo para la toma de imágenes en un microscopio invertido: los pequeños imanes incrustados en la caja de imágenes facilitan la fijación de la ventana de imagen craneal (CIW). En los experimentos mostrados en este protocolo, se utilizó un microscopio invertido. Para microscopios verticales, la fijación se puede lograr mediante una barra o un anillo con ranuras que se pueden conectar al microscopio con la ayuda de tornillos o una placa que se ajuste al anillo. Para el manejo del dolor, inyectar una dosis única de 100 g/kg de buprenorfina por vía subcutánea y permitir que el animal se recupere en una almohadilla de calentamiento. Coloque el ratón en una jaula individual con papel triturado para su enriquecimiento. Supervise de cerca el ratón diariamente durante los primeros días y 2 veces por semana, a partir de entonces, para el comportamiento normal, la reactividad y la apariencia. 2. Imágenes intravitales NOTA: El intervalo de tiempo entre la inyección de células tumorales y la primera sesión de diagnóstico por imágenes intravital depende del tipo de línea celular tumoral utilizada. Para los experimentos mostrados en este protocolo, 1x 105 células GL261 fueron inyectadas e imágenes 10 días más tarde. Preparación de imágenes Sedar el ratón usando anestesia por inhalación de isoflurano a través de una mascarilla facial (1,5%–2% mezcla de isoflurano/O 2). Inyectar el ratón por vía subcutánea con 100 ml de tampón salino para evitar la deshidratación.NOTA: Para obtener imágenes a largo plazo, el ratón se puede hidratar a través de una bomba de perfusión subcutánea. Coloque el ratón boca arriba en una caja de imágenes. Utilice una placa metálica con un orificio de 1 mm de diámetro y pequeños imanes incrustados alrededor de la abertura para proporcionar la fijación del CIW a la caja de imágenes. Introducir isoflurano a través de una mascarilla facial y ventilar por una salida en el otro lado de la caja (0.8%–1.5% mezcla de isoflurano/O 2). Opcionalmente, utilice cinta adhesiva para fijar el cuerpo del ratón.NOTA: El deextran etiquetado fluorescentemente para la visualización de los vasos sanguíneos u otros colorantes se pueden inyectar por vía intravenosa en este punto. Opcionalmente, utilice un oxímetro de pulso y una sonda de calentamiento para monitorear los signos vitales del ratón.NOTA: En este experimento, no fue necesario utilizar un oxímetro de pulso y una sonda de calentamiento ya que el ratón estaba estable durante todo el período de tiempo de imagen (2-3 h). Sin embargo, para tiempos de diagnóstico por imágenes más largos, es posible que se necesite un control más exhaustivo. Establezca el objetivo de agua 25x (por ejemplo, HCX IRAPO NA0.95 WD 2.5 mm) en la posición zmás baja y agregue una gran gota de agua.NOTA: El uso de un microdispensador de inmersión en agua es muy recomendable para experimentos a largo plazo, ya que permite a los científicos agregar agua durante el experimento. Alternativamente, se puede utilizar un objetivo seco. Transfiera la caja de imágenes al microscopio equipada con una cámara de clima oscuro mantenida a 37 oC. Lleve el objetivo al cubreobjetos CIW hasta que la gota de agua lo toque. Usando el modo de epifluorescencia, observe el tumor a través del ocular y ponga las células en el foco. Adquisición de imágenes de lapso de tiempo Seleccione varias posiciones de interés para la imagen y registre sus coordenadas en el software. Asegúrese de que las posiciones seleccionadas sean posiciones representativas de diferentes sitios del tumor (cada tumor puede ser diferente, pero para garantizar la consistencia, seleccione la misma cantidad de posiciones que son centrales para el núcleo del tumor y en los bordes de todos los ratones).NOTA: Se puede realizar una exploración de azulejos de una parte del tumor o de todo el tumor visible; sin embargo, si el tumor es grande, este método aumentará el lapso de tiempo entre las imágenes. Además, si las células tumorales se mueven rápidamente, puede ser difícil rastrear las mismas células con el tiempo. Cambie al modo multifotón y ajuste el láser a la longitud de onda correcta. Tenga en cuenta que, para evitar el fotodaño, se desean longitudes de onda más altas.NOTA: Para la toma de imágenes Dendra2, se utilizó una longitud de onda de 960 nm. Con el objetivo utilizado en estos experimentos, un zoom de 1.3 fue suficiente para obtener una buena resolución de los núcleos tumorales y escanear un área representativa del tumor. Vaya al modo en vivo y defina una z-stack para cada posición con el fin de adquirir el volumen máximo de células tumorales sin comprometer la resolución de la célula tumoral. Defina el tamaño del paso entre las imágenes como 3 m. Utilice el modo bidireccional para aumentar la velocidad de escaneo. La resolución de la imagen debe ser de al menos 512 x 512 píxeles. Adquirir imágenes del volumen del tumor en diferentes posiciones cada 20 minutos durante 2 h. Añadir agua al objetivo antes de cada adquisición de imagen.NOTA: Las imágenes de lapso de tiempo se pueden adquirir automáticamente estableciendo el lapso de tiempo correcto en el software. Sin embargo, el ratón puede moverse y la posición o z-stack puede cambiar con el tiempo, lo que provoca la pérdida de datos. Por lo tanto, se recomienda realizar el lapso de tiempo manualmente y comprobar y ajustar los cambios xyz entre adquisiciones. En este paso, opcionalmente, cambie el marcador fluorescente Dendra2.NOTA: A diferencia de las imágenes de lapso de tiempo (que permite estudiar las propiedades de las células tumorales individuales y cómo cambian con el tiempo), esto permitirá estudiar el área de la infiltración de células tumorales en el cerebro durante varios días4. Gligorijevic et al.13describe nal. Después de que se adquiera la última imagen, retire el ratón del escenario y permita que se recupere en una almohadilla de calentamiento. Para prevenir la deshidratación, se pueden administrar por vía subcutánea 100 l de salina. Coloque el ratón en su jaula hasta que se realice una lesión similar a la biopsia. 3. Lesión similar a la biopsia y reemplazo de CIW Cree una lesión similar a una biopsia en el sitio del tumor 1 día después de la primera sesión de diagnóstico por imágenes.NOTA: Alternativamente, se puede realizar otro procedimiento, como la extirpación parcial del tumor. Sedar el ratón utilizando anestesia por inhalación de isoflurano como se describió anteriormente en el paso 2.1.1.NOTA: Si bien se puede utilizar anestesia inyectable, este procedimiento es más corto que la implantación de CIW, y la anestesia por inhalación permite controlar y reducir con precisión el tiempo que el ratón permanece sedado. Coloque el ratón sobre un marco estereotaxico y fije su cabeza con dos barras para los oídos y una abrazadera nasal. Compruebe la profundidad de la anestesia por la falta de reflejos del pedal. Use una mascarilla de anestesia para la cirugía estereotaxia para mantener el ratón sedado durante el procedimiento. Remoje un hisopo de algodón en acetona y extiéndalo alrededor del borde de la cubierta para suavizar el pegamento que sostiene el cubreobjetos contra el cerebro. Deslice los fórceps de punto fino debajo de la cubierta para levantarlo. Si el cubreobjetos se rompe en este punto, utilice los fórceps para retirar los trozos de vidrio. Aplica un tampón de corteza para mantener el cerebro húmedo. Sumerja una aguja de 25 G en el tumor a una profundidad de 1 mm. Retire la aguja y detenga el sangrado, si es necesario, aplicando una esponja estéril de gelatina.NOTA: Este paso se puede realizar bajo un estereomicroscopio fluorescente para identificar con mayor precisión la zona del tumor (si el tumor es demasiado pequeño). Además, se puede inyectar una solución de 1 l de poliestireno fluorescente de 1 m de perlas durante la punción para identificar el área biopsiada. Selle la superficie del cerebro con aceite de silicona y pegue un cubreobjetos de 6 mm en la parte superior. 4. Imágenes repetidas Un día después de infligir la lesión similar a la biopsia (y en días consecutivos si es necesario), repita las imágenes intravitales como se describe en el paso 2 anterior para evaluar cómo cambia el comportamiento de las células tumorales con el tiempo. Seleccione varias posiciones del tumor que serían representativas de toda la zona del tumor.NOTA: Si se utilizaron perlas fluorescentes para identificar el área biopsiada, localícelas para crear una imagen del comportamiento de las células tumorales en las regiones biopsiadas en comparación con las regiones no biopsiadas. 5. Análisis de imágenes Si las imágenes de lapso de tiempo se adquirieron manualmente, combínelas en una carpeta. Abra el archivo LIF de lapso de tiempo en el software comercial asociado con el microscopio (por ejemplo, LasX o LAS AF). Seleccione la pestaña Proceso > Herramientas de proceso > Combinar. Seleccione la primera imagen de la secuencia de tiempo y haga clic en Primero. Seleccione la segunda imagen de la secuencia de tiempo y haga clic en Segundo. En Fusionar cotas, seleccione t para el tiempo. Haga clic en Aplicar. Se generará un nuevo archivo con dos puntos de tiempo. Repita este proceso para todos los puntos de tiempo, utilizando el archivo recién generado como la primera imagen de la secuencia. Corrija las z-stacks adquiridas para cualquier desplazamiento xyz. NOTA: Para los experimentos descritos en este protocolo, se utilizó un programa de software de Visual Basic diseñado a medida para la corrección. Alternativamente, se puede utilizar otro software disponible, como ImageJ o Imaris. Exporte los archivos TIFF desde el software haciendo clic con el botón derecho en el archivo de lapso de tiempo combinado. Seleccione Guardar datos RAW. Los archivos exportados se exportarán a una carpeta nombrada según el canal, la hora y la posición z. Abra los archivos TIFF en el programa de software de Visual Basic diseñado a medida. Defina el número de puntos de tiempo, pilas zy canales. Asigne un color a cada canal por el orden de aparición. En el panel Mostrar formulario, para cada punto de tiempo, corrija el desplazamiento en la z haciendo clic en los botones arriba (U) o abajo (D). En el panel de creación de imágenes Intravital, seleccione el canal que se utilizará para corregir el desplazamiento xy. Seleccione el canal verde que desea corregir, en función de la señal de las células tumorales. Haga clic en Automático para la corrección xy. Exporte las imágenes corregidas como una proyección máxima de tres pilas zconsecutivas. En el panel Selección, introduzca los números del primero (Inicio) y el último (Fin) z-slices que se exportarán. Seleccione Máx. Seleccione Carpetas separadas para Z. Haga clic en Hacer. Para cada uno de ellos, tres z-pilas, imágenes de lapso de tiempo se exportarán a una carpeta independiente. Opcionalmente, corrija la deformación elástica del tejido.NOTA: Para los experimentos de deformación elástica de tejido, se utilizó un programa de software de compensación de movimiento de coincidencia para corregir la deformación de tejido rígido y elástico14. Realice un seguimiento de las celdas individuales en la pila zcompleta en la película de lapso de tiempo.NOTA: Las celdas tumorales se pueden rastrear manualmente utilizando, por ejemplo, un plugin ImageJ (MTrackJ). Aunque es preciso, esto se limita al plano xy y consume mucho tiempo. Alternativamente, las células tumorales se pueden rastrear automáticamente a lo largo del volumen zcompleto, utilizando la segmentación de células tumorales (por ejemplo, el software Imaris). Sin embargo, en tumores muy densos, el seguimiento automatizado es menos preciso y puede dar lugar a más errores de seguimiento. Abra y realice un seguimiento de cada serie de lapso de tiempo (durante tres pilas zconsecutivas) por separado. Arrastre la carpeta que contiene las imágenes de lapso de tiempo a ImageJ. Seleccione la pestaña Plugins > Tracking > MtrackJ. Realice un seguimiento de cada celda individual seleccionando Agregar y haciendo clic en cada celda en cada punto de tiempo. Extraiga la medida de las pistas haciendo clic en Medir y guardando el archivo.