脑肿瘤细胞行为的纵向生命成像,以响应侵入性手术活检

所有实验均按照荷兰皇家艺术和科学学院动物福利委员会的指导方针进行。本手稿中使用的实验协议得到了中央委员会(CCD)和实例蒂·迪尔维尔齐恩(IvD)的批准。 1. 肿瘤细胞植入和颅内成像窗口制备 手术准备 使用任何菌株或性别的成年小鼠(>6 周大)。在无菌水中以1:1:2的剂量注射(氟尼松[神经素]+芬太尼[阿片类])(0.4 mL/kg)+苯并二氮杂卓镇静剂(2毫克/千克)。通过脚趾捏评估动物的镇颤状态。注:在本协议中,由于这些实验中使用的肿瘤细胞系的遗传背景相同(GL261),因此使用了雌性和雄性C57BL/6小鼠。小鼠将完全镇静1.5小时。或者,使用吸入麻醉,如非氟(1.5%~2%的黄豆胶/O2混合物)。 将鼠标安装在立体定向框架上,并使用鼻夹和两个耳杆固定头部。 使用加热灯保持体温。加热灯应谨慎使用,也可以使用水循环加热垫。 应用眼膏保护小鼠角膜不干燥。 使用锋利的剪刀来剪下头骨上的毛皮(从老鼠眼睛到头骨底部的背区域),用70%乙醇对暴露的皮肤进行消毒。 用锋利的剪刀以圆形的方式切割皮肤,用棉签刮掉下面的骨皮。在 5 分钟内涂抹一滴利多卡因 1% + 肾上腺素 1:100,000,用棉签去除多余的。 用氰丙烯酸酯胶水将皮肤边缘粘到头骨上。 将立体定向帧置于具有 4 倍放大倍率的解剖立体显微镜下。 通过解剖显微镜可视化头骨,并在右骨上钻出直径为 5 mm 的圆形凹槽。小心地执行此步骤,只是肤浅地执行此步骤,避免对头骨施加任何压力。 应用一滴皮层缓冲液(125 mM NaCl,5 mM KCl,10 mM 葡萄糖,10 mM HEPES 缓冲液,2 mM MgSO4和 2 mM CaCl2 [pH 7.4]),并使用细钳提起骨瓣。 对于以下步骤,除非另有说明,否则保持大脑表面覆盖皮层缓冲液。 在解剖显微镜下,可视化大脑表面,并使用弯曲的、锥形的、非常精细的点钳去除杜拉母体。如果在此阶段出现出血,请使用可吸收的明胶海绵将其停止。 肿瘤细胞注射 在PBS的±3μL中重新悬浮所需的荧光肿瘤细胞(例如,对于本方案所示的实验,注射了1 x 105 GL261细胞)。注:虽然可以使用任何荧光标记,但强烈建议在分析过程中跟踪单个肿瘤细胞。此外,与组蛋白相关的荧光标记,如H2B,可用于可视化染色体凝结,从而监测细胞分裂。使用照片可切换标记,如Dendra2,允许在几天4,13对肿瘤细胞进行照片标记和跟踪。 用点型2针将肿瘤细胞装入10μL气密注射器中,并将其固定在立体机械手手臂上。 取出皮层缓冲液。将注射器的尖端放在颅骨切除术的中间,并将其插入离头骨表面 0.5 mm 的深度。或者,在大脑中创建一个小空间,以适应肿瘤细胞悬浮。为此,将注射器插入至 1 mm 的深度,然后在注射前将其取回至 0.5 mm。 应用一滴皮层缓冲液。 使用微注射器泵喷油器(250~400 nL/min)缓慢注入细胞悬架。取出注射器,必要时使用可吸收的明胶海绵止血。 颅内成像窗口准备 取出皮层缓冲液,在颅骨切除部位放置一滴硅油,以避免窗户下的气泡。 用 6 毫米盖玻片密封暴露的大脑。在盖玻片和头骨之间涂抹氰丙烯酸酯胶水。在细钳的帮助下,轻轻地将盖玻片压在头骨上,以确保大脑和盖玻片之间的距离最小。 在头骨表面涂上牙科丙烯酸水泥,覆盖盖玻片的边缘。在颅骨周围放置一个薄的不锈钢环(外径1.5毫米,内径1毫米),让牙科水泥干燥。或者,在边框上添加一些胶水,以确保头部顶部的环。注:此头部固定系统最适合在倒置显微镜上成像:嵌入在成像盒中的小磁铁有助于颅内成像窗口 (CIW) 固定。在该协议所示的实验中,使用了倒置显微镜。对于直立显微镜,可以通过带凹槽的杆或带凹槽的环实现固定,这些凹槽可以通过螺钉或适合环的板连接到显微镜上。 对于疼痛管理,注射单剂量为100微克/千克丁丙诺啡皮下,让动物在加热垫上恢复。 将鼠标放入单独的笼子里,用切碎的纸张进行浓缩。在最初几天和之后每周2次密切监视鼠标的正常行为、反应性和外观。 2. 生命内成像 注:肿瘤细胞注射和第一次生命内成像期之间的时间间隔取决于所使用的肿瘤细胞系的类型。对于该协议所示的实验,10 105 GL261细胞在10天后被注射并成像。 成像准备 通过面罩(1.5%~2%的胶质/O2混合物)使用非法兰吸入麻醉麻醉小鼠。 下皮注入小鼠100 μL的盐水缓冲液,以防止脱水。注:对于长期成像,小鼠可以通过皮下输液泵进行水合。 将鼠标正面朝上放在成像框中。使用直径为 1 mm 的金属板和嵌在孔径周围的小磁铁,将 CIW 固定在成像盒上。通过面罩引入电子芦,并通过盒子另一侧的插座(0.8%~1.5%的外卢兰/O2混合物)通风。或者,使用磁带修复鼠标主体。注:此时可静脉注射荧光标记的dextran,用于血管可视化或其他染料。 或者,使用脉冲血氧仪和加热探头来监测小鼠的维有性。注:在本实验中,由于小鼠在整个成像周期(2~3 小时)中保持稳定,因此无需使用脉冲血氧仪和加热探头。但是,对于较长的成像时间,可能需要更彻底的监控。 将 25 倍(例如 HCX IRAPO NA0.95 WD 2.5 mm)水目标设置为最低z位置,并添加大量水。注:对于长期实验,强烈建议使用浸入式微型分配器,因为它允许科学家在实验过程中加水。或者,可以使用干燥目标。 将成像盒转移到装有37°C黑暗气候室的显微镜上。将目标带到 CIW 盖玻片上,直到水滴碰到它。 使用荧光模式,通过目镜观察肿瘤,使细胞进入焦点。 延时图像采集 选择要成像的多个感兴趣位置,并在软件中记录其坐标。确保所选位置是来自肿瘤不同部位的代表性位置(每个肿瘤可能不同,但为了确保一致性,请选择相同数量的位置,这些位置是肿瘤核心和所有小鼠边缘的核心位置)。注:可对肿瘤的一部分或整个可见肿瘤进行瓷砖扫描;然而,如果肿瘤很大,这种方法将增加图像之间的延时。此外,如果肿瘤细胞快速移动,随着时间的推移跟踪相同的细胞可能具有挑战性。 切换到多光子模式,并将激光调谐到正确的波长。请注意,为了避免光损伤,需要更高的波长。注:对于 Dendra2 成像,使用了 960 nm 波长。在这些实验中使用的目标,1.3的变焦足以获得肿瘤核的良好分辨率,并扫描肿瘤的代表性区域。 进入活动模式,为每个位置定义一个z-stack,以获得肿瘤细胞的最大体积,而不影响肿瘤细胞的分辨率。将图像之间的步长大小定义为 3 μm。 使用双向模式提高扫描速度。图像分辨率应至少为 512 x 512 像素。 每20分钟获取不同位置的肿瘤体积图像,每次采集2小时。每次采集图像前向目标加水。注:通过在软件中设置正确的延时时间,可以自动获取延时图像。但是,鼠标可以移动,位置或z堆栈可能会随时间变化,从而导致数据丢失。因此,建议手动执行延时,并检查和调整收购之间的xyz偏移。 在此步骤中,可以选择使用照片切换 Dendra2 荧光标记。注:与延时成像(允许研究单个肿瘤细胞的特性及其如何随时间变化),这将允许研究肿瘤细胞渗透在大脑的区域在几天内4。格利戈里耶维奇等人对这一步骤作了详细的解释。 获取最后一张图像后,将鼠标从舞台上移除,使其在加热垫上恢复。为了防止脱水,100 μL的盐水可以分皮。将鼠标放在笼子中,直到进行活检伤害。 3. 类似活检的伤害和CIW更换 在第一次成像后1天,在肿瘤部位创建类似活检的损伤。注:或者,也可以执行另一个程序,如部分肿瘤切除。 如步骤 2.1.1 所述,使用非二苯吸入麻醉小鼠。注:虽然可以使用注射麻醉,但此过程比 CIW 植入短,吸入麻醉可以精确控制和减少小鼠静镇时间。 将鼠标放在立体框架上,用两个耳条和鼻夹固定其头部。由于缺乏踏板反射,检查麻醉深度。使用麻醉面罩进行立体手术,使小鼠在手术过程中保持镇静。 将棉签浸泡在丙酮中,将其铺在盖玻片的边缘,以软化将盖玻片固定在大脑上的胶水。 将薄点钳滑到盖玻片下方以将其提起。如果此时盖玻片断裂,请使用钳子取出玻璃片。 应用皮层缓冲液,保持大脑湿润。 将25G的针头浸入肿瘤深度为1毫米,必要时应用明胶无菌海绵,取出针头并停止出血。注:此步骤可在荧光立体显微镜下执行,以更准确地识别肿瘤区域(如果肿瘤太小)。此外,在穿刺过程中,可注射荧光聚苯乙烯1μm珠子的1μL溶液,以识别活检区域。 用硅油密封大脑表面,并在顶部粘上6毫米的盖玻片。 4. 重复成像 在造成活检一样的损伤一天后(如果需要,在连续几天)后,重复生命内成像,如上文第 2 步所述,以评估肿瘤细胞行为如何随时间而变化。选择代表整个肿瘤区域的肿瘤的几个位置。注:如果使用荧光珠来识别活检区域,则与非活检区域相比,将荧光珠子定位为在活检区域中成像肿瘤细胞行为。 5. 图像分析 如果手动获取延时图像,则将它们合并到一个文件夹中。 在与显微镜(例如,LasX 或 LAS 自动对焦)相关的商业软件中打开延时 LIF 文件。选择”流程>流程工具>合并”选项卡。选择时间序列的第一个图像,然后单击”第一个”。选择时间序列的第二个图像,然后单击”第二个”。在”合并维度”中,选择t表示时间。单击”应用”。将生成具有两个时间点的新文件。对所有时间点重复此过程,使用新生成的文件作为序列的第一个图像。 更正任何xyz移位时获取的z堆栈。注:对于该协议中描述的实验,使用自定义设计的 Visual Basic 软件程序进行更正。或者,可以使用其他可用的软件,如 ImageJ 或 Imaris。 通过右键单击合并的延时文件从软件导出 TIFF 文件。选择”保存原始数据”。导出的文件将导出到根据通道、时间和z位置命名的一个文件夹。 在自定义设计的可视化基本软件程序中打开 TIFF 文件。 定义时间点、z 堆栈和通道的数量。 按外观顺序为每个通道分配颜色。 在”窗体显示”面板中,每个时间点通过单击向上 (U) 或向下 (D) 按钮来更正z中的偏移。 在”生命内部图像构建”面板中,选择要用于校正xy偏移的通道。根据来自肿瘤细胞的信号选择要纠正的绿色通道。单击”自动”进行xy校正。 导出更正后的图像,作为三个连续z堆栈的最大投影。在”选择”面板中,引入要导出的第一个 (开始)和最后一个 (结束) z切片的编号。选择”最大值”。为 Z 选择单独的文件夹。单击”执行”。对于每个 z 堆栈,将导出到单独的文件夹的延时图像。 或者,纠正组织弹性变形。注:对于组织弹性变形实验,使用匹配运动补偿软件程序对刚性和弹性组织变形进行校正14。 在延时影片中跟踪完整z堆栈中的单个单元格。注:可以使用ImageJ插件(MTrackJ)等手动跟踪肿瘤细胞。虽然准确,这是限于xy平面,是非常耗时的。或者,肿瘤细胞可以在整个z体积中自动跟踪,使用肿瘤细胞分割(例如,Imaris软件)。然而,在高致密的肿瘤中,自动跟踪不太准确,并可能导致更多的跟踪错误。 分别打开和跟踪每个延时序列(连续三个z堆栈)。将包含延时图像的文件夹拖动到 ImageJ。 选择选项卡插件>跟踪> MtrackJ.通过选择每个时间点的”添加”和”单击每个单元格”来跟踪每个单独的单元格。 通过单击”测量”并保存文件来提取轨道的度量。