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Krebsforschung

체 외 종양 세포 Rechallenge 공상 항 원 수용 체 T 세포 Antitumor 기능 예측 평가

Published: February 27, 2019
doi:
10.3791/59275
, , , , ,
1Department of Hematology & Hematopoietic Cell Transplantation, T Cell Therapeutics Research Laboratory,City of Hope Beckman Research Institute and Medical Center, 2Irell and Manella Graduate School of Biological Sciences,City of Hope Beckman Research Institute and Medical Center

Summary

여기, 생체 외에서 공동 문화 메서드를 재귀적으로 도전 종양 표적으로 T 세포, antitumor T 세포 활동의 phenotypic 및 기능 분석에 대 한 수 있습니다 설명 합니다.

Abstract

공상 항 원 수용 체 (자동차) T 세포 치료 분야는 자동차 디자인, 유전자 공학 접근 및 제조 최적화 개선 급속 하 게 전진 된다. 그러나 이러한 개발 노력에 대 한 하나의 도전, 튼튼하게 vivo에서 치료 성공 위한 최적의 자동차 T 셀 제품의 선택에 게 알릴 수 있는 생체 외 분석 실험의 설립 되었습니다. 표준 체 외 종양 세포 분석 실험 종종 상대적으로 짧은 공동 문화 시간 및 높은 T 세포 종양 비율 차 T 세포의 진정한 antitumor 잠재력을 반영 하지. 여기, 우리는 높은 종양 세포 부하에서 잠재력을 죽이 자동차 T 셀 재귀를 평가 하는 생체 외에서 공동 문화 방법 설명. 이 분석 결과, 장기 세포 독성 기능 및 자동차 T 세포의 증식 능력에 검사 체 외에 7 일 동안 추가 종양 대상 공동 문화 매일 관리 합니다. 이 분석 결과 프로 파일링 T 세포 활성화, 피로와 메모리 고기 결합 될 수 있다. 이 분석 결과 사용 하 여, 우리는 성공적으로 구분 CD4의 기능과 phenotypic 차이점+ 와 CD8+ 차 T 세포종에 대 한 세포 (GBM) 세포, orthotopic에서 그들의 차동 vivo에서 antitumor 활동 반영 이 종이 식 모델입니다. 손쉬운 접근을 자동차 T 세포 효능을 평가 하 고 기능 변화를 명료 하 게 다른 차 T 셀 제품을 제공 합니다.

Introduction

Immunotherapy 공상 항 원 수용 체 (자동차)를 사용 하 여-설계 된 T 세포 B 세포 악성 종양1,2,3,4, 동안 다른 종양을 표적으로 하기의 가능성에 대 한 유망한 결과 본 엄격한 조사가5,,67되 고 있습니다. 큰 진전이 자동차 구조, 제조 공정 및 환자 사전 주입 식이요법6,7,8, 최적화 및 새로운 합성 생물학 접근 증가 것으로 예상 된다 그들의 지 속성, 안전 및 종양 특이성9,10. 그러나, 그것은 어렵고 적절 하 게 임상 번역에 대 한 최선의 선택 가이드 위해 자동차 T 세포의 치료 잠재력을 평가 하기 위해 노동 집약 되었습니다. 가장 설립 된 모델까지 차 T 세포의 기능을 평가 하는 인간의 종양 xenografts, 그것에 의하여 차 T 세포 antitumor 효능에 대 한 검사 하 고 적정 한 셀 복용량11,12 에 비해 베어링 immunodeficient 마우스에 , 13 , 14 , 15. 이러한 생체 조건 murine 연구는 노동 집약 하 고 시간이 걸리는, 많은 수의 매개 변수를 검사 하는 경우에 특히. 더, vivo에서 학문 마우스 긴장과 동물 시설, 동물 처리 기술에의 접근에 의해 제 지 될 수 있습니다. 따라서,이 T 세포의 생체 조건 antitumor 기능 또한 충실 하 게 반영 하는 이펙터 활동의 빠른 정보에 대 한 허용 더 편리 생체 외 분석 실험을 개발할 필요가 있다.

생체 외에서 T 세포의 세포 독성을 결정 하기 위해 기존의 방법 degranulation, cytokine 생산 및 방사성 표시 대상 셀 (즉,: 크롬 방출 분석 실험) lyse 수의 탐지에 집중 했다. 이러한 분석 실험 차 T 세포 특이성 및 리디렉션된 대상 인식에 대 한 유익 하지 않습니다, 그들은 종종 조작된 T 세포12,,1316의 vivo에서 antitumor 잠재력을 반영 하지. 경우에 따라 체 외에서 단기 분석 실험에서 활동 죽이 보였다 vivo에서 antitumor 기능16역 상관 관계. 이러한 불일치 가능성이 높은 이펙터: 대상 (E:T) 비율 경향이 피로17차 T 셀 제품을 차별화 하는 데 이러한 생체 외 분석 실험에 따라서 무 능력 사용의 결과 이다. 대조적으로, vivo에서 종양 퇴치 T 동안 세포 일반적으로 응답 함으로써 사망 하 고 이후 운전 T 세포 감 별 법 및 고갈18,19, 의 여러 라운드를 요구 하는 큰 종양 부담에 대 한 20, 자동차 t 효과적인 종양 클리어런스에 대 한 주요 장벽 중 하나는 세포12,13. 한편, 대부분 단기 생체 외에서 살인 분석 실험도 할 T 세포 증식에 판독 차이 하지 반면 차 T 세포 치료 환자에서 차 T 세포 확장에 대 한 능력은 강하게 연관 임상 응답4. 따라서, 적절 한 체 외 분석 결과 높은 종양 부담, T 세포 소모의 유도의 상태를 정리 해야 하 고 T 세포 확장의 판독에 대 한 있습니다.

여기는 간단한 체 외 공동 문화 분석 결과와 잠재력을 죽이 반복적인 종양에 대 한 자동차 T 세포를 평가 하는 전략에 설명 합니다. 다른 T 세포 효과 기 활동 매개 변수 수 수 동시에, 시험 대상 셀 살인, 자동차 T 셀 확장 및 메모리 관련 또는 소모 된 고기를 포함 하 여. 이 분석 결과에서 생성 된 결과 자동차 T 세포의 생체 조건 antitumor 효력으로 잘 연결 하 고 자동차 T 셀 제품의 효능을 평가 하기 위해 악용 될 수 있습니다. IL13Ra2 대상 자동차 T 세포 주 GBM 라인21에 대 한 평가 분석 결과, 설명 하는 동안 어떤 자동차 T 셀 플랫폼에 쉽게 적응 될 수 있다.

Protocol

우리의 IRB는이 프로토콜의 검토를 요구 하지 않는다. 시의 희망 병 리 학과에서 코딩은 폐기 신선한 세포종 종양 샘플을 접수 하 고 우리 연구소는 키에 액세스할 수 없습니다. 우리는 식별 데이터가 없는 생/절제의 시간에서 이전 치료 및 질병 상태에만 데이터를 견본을 받을. 1. 미디어 준비 GBM 셀 선 주 배양 신경 줄기 세포 미디어 준비: DMEM:F12, 1시 50분 B27, 5 µ g/mL 헤 파 린, 그리고 2 mmol/L L-글루타민; 20 ng/mL 표 피 성장 인자 (EGF)와 20 ng/mL 기본적인 섬유 아 세포 성장 인자 (FGF) 일주일에 두 번 보충 ( 재료의 표참조). T 세포 미디어 준비: X-VIVO 15 10% 태아 종 아리 혈 청 (FCS);을 포함 하 ( 재료의 표참조) 모든 48 h 70 IU/mL rhIL 2와 0.5 ng/mL rhIL-15 보충. 공동 배양을 준비: EGF와 FGF 보충 없이 신경 줄기 세포 미디어 고 10 S 추가. FACS 얼룩이 솔루션 (FSS) 준비: HBSS, 2 S 할머니3 (0.5 g/500 mL). 2입니다. 준비 GBM 종양 세포의 4 분에 대 한 300 x g 에서 원심 분리에 의해 낮은 통로 GBM 종양 분야 (TSs)을 수확 하 고 상쾌한 삭제.참고: GBM 종양 분야 (TSs)에서 생성 됩니다22,,2324, 위에서 설명한 대로 종양을 절제 하 고 37 ° c.에 5% CO2 인큐베이터에서 신경 줄기 세포 미디어에서 유지 37 ° C 물 욕조에 미리 따뜻한 공동 문화 미디어. GBM TSs에 찬 accutase의 1 mL을 추가 하 고 30-60 s pipetting으로 TSs 해리 따뜻한 공동 문화 미디어의 5 mL을 추가 하 여 분리를 중지.참고: GBM TSs는 5 분 이상에 대 한 accutase에 보관해 서는 한다. 4 분의 300 x g 에서 원심 분리에 의해 GBM 세포를 수확, 상쾌한, 삭제 하 고 셀 공동 문화 미디어의 2 mL에 resuspend. 세포 생존 카운터를 사용 하 여 셀 농도 결정 합니다.참고: 세포 생존 능력 있어야 > 70%. 3입니다. 자동차 T 세포의 준비 분석 결과, 전에 24 시간 미만 흐름 cytometry 튜브로 경작된 차 T 세포의 100 µ L 고 금감원의 2 개 mL를 추가.참고: 자동차 T 세포11,21 위에서 설명한 대로 생성 되었고 T 셀 미디어에서 경작. 4 분 및 폐기 상쾌한 300 x g 에서 원심 분리. 셀, 4 분, 300 x g 에서 원심 분리기를 씻어 FSS의 2 개 mL를 추가 하 고 상쾌한 삭제. 30 분 동안 4 ° C에서 자동차 식을 나타내는 적절 한 항 체와 세포 얼룩.참고: 예를 들어 설명 하는 IL13Rα2 대상 자동차 이전25 사용 됩니다, 그리고 안티-IL13 항 체와 함께 다음 얼룩이. FSS의 2 mL로 두 번 세척 하 고 자동차 exn 교류 cytometer를 사용 하 여 분석. 그림 1B제어 전략을 사용 하 여 T 세포에 차 %를 결정 합니다. 공동 문화 일에 4 분의 300 x g 에서 원심 분리 하 여 모든 자동차 T 세포를 수확 하 고 상쾌한, 폐기 공동 문화 미디어의 2 mL에 셀 resuspend. 세포 생존 카운터를 사용 하 여 셀 농도 결정 합니다.참고: 세포 생존 능력 있어야 > 70%. 4. 종양 설정-T 세포 공동 문화 종양 세포 공동 문화 미디어 0.16 백만/mL의 농도를 희석. 자동차 T 세포 공동 문화 미디어와 0.04 백만 자동차+ 셀/mL의 농도를 희석 자동차 %에 따라 달라 집니다.참고: 예를 들어 자동차 50% 이며 T 세포 농도 0.4 백만/mL, 경우 0.04 백만 자동차+ 셀/mL의 최종 농도를 1:5 희석을 확인 합니다. -바닥이 96-잘 빠진 조직 배양 플레이트의 각 음에 희석된 종양 세포의 100 µ L를 플라스틱. 에 있는 종양 세포와 혼합 잘 각 잘 희석된 차 T 세포의 100 µ L를 플라스틱.참고: 각 종양 T 셀 공동 문화 4 시간 지점에서 분석 될 것 이다. 때마다 다른 분석을 기반으로 포인트 4-6 복제에서 필요할 수도 있지만 < 시간 포인트 당 3 복제 권장 되지 않습니다; 대표 platemap 표 1 을 참조 하십시오. 37 ° C, 5% CO2 배양 기에서에서 접시를 유지 합니다. 5. 종양 세포 Rechallenge 참고: Rechallenge 2, 4, 6 일 게시물 초기 공동 문화 설치 (그림 1A)에서 일어난다. 수확 하 고 (단계 2.1 2.6) 위에서 설명한 대로 GBM TSs 해리. GBM 0.64 백만/mL의 농도에서 세포 resuspend Rechallenge 필요 공동 문화 우물을 확인 (하십시오 표 1참조) 각 우물의 상단에서 50 µ L 미디어를 조심 스럽게 제거 하 고. 각 우물에 GBM 세포 현 탁 액의 50 µ L을 추가 하 고 잘, 다음 37 ° C, 5% CO2 배양 기에 다시 접시를 넣어. 6. 수확 샘플 및 Cytometric 분석 흐름 참고: 샘플은 각각 종양 도전의 초기 공동 문화 설치 1, 2, 3, 4 라운드는 1, 3, 5, 7 일 게시물에서 수확 될 것입니다. 37 ° C waterbath에 미리 따뜻한 0.05% 트립 신-EDTA 솔루션. 수확을 해야 하 고 새로운 라운드 아래 96 잘 접시로 미디어를 전송 하는 우물을 결정 합니다. 5 분 동안 37 ° C에서 남아 있는 종양 세포를 소화 하기 위해 우물에 트립 신-EDTA의 50 µ L 플라스틱. 현미경으로, 세포는 바닥에서 분리 확인 합니다. 분리 된 셀, resuspend 다음 전송 트립 신-EDTA 라운드 아래 96 잘 접시의 해당 우물을 분리 된 셀을 포함 하는 잘 바닥 주위 플라스틱. 분리기 300 x g, 4 분, 4 ° C에서 라운드-아래 96 잘 접시 다음 상쾌한을 삭제 합니다. 셀, 300 x g에서 원심 분리기, 4 분, 4 ° C에 세척 하는 FSS의 200 µ L/잘 추가 후 상쾌한 삭제. Resuspend 세포 100 µ L/잘 FSS 포함 항 체 ( 재료의 표참조), 그리고 30 분 동안 4 ° C에서 얼룩 세포. 셀에 100 µ L/잘 FSS를 추가, 삭제 상쾌한 다음 300 x g, 4 분, 4 ° C에서 원심. 셀, 300 x g에서 원심 분리기, 4 분, 4 ° C에 세척 하는 FSS의 200 µ L/잘 추가 후 상쾌한 삭제. Resuspend 100-200 µ L/잘 500 ng/mL DAPI와 금감원의 셀 다음 cytometry에 의해 샘플을 분석 합니다. 7. 기능 및 자동차 T 세포의 중독 Otypic 분석 교류 cytometer에서 데이터 파일을 검색 하 고 모든 라이브 (DAPI-) 세포 (그림 1C) 게이트. 종양 세포는 CD45 게이팅 하 여 계량- 인구와 자동차 T 세포는 CD45 게이팅 하 여+, 자동차 + 인구 (그림 1C).참고: 종양 세포 CD45 표현 하는 경우 (예: 들의 삶 문의 림프 세포), 안티-CD3 얼룩 종양 세포에서 T 세포를 차별화 하는 데 사용할 수 있습니다. 종양 세포와 시간 코스를 통해 자동차 T 휴대폰 번호 플롯. 4-1BB와 CD69 공동 식으로 T 세포 활성화를 확인 합니다.참고: 이러한 표면 마커는 T 세포 활성화 6-24 h 게시물 초기 공동 문화 분석을 사용할 수 있습니다. PD-1, 지연-3 팀-3의 식에 의해 T 세포 소모를 식별 합니다. CD45RO CD62L의 식으로 T는 세포 메모리 상태를 확인 합니다.

Representative Results

위에서 설명한 분석 결과 사용 하 여, 우리 차동 이펙터 힘을 구별 해야 하 고 CD4 중재 역학을 죽이고+ 와 CD8+ 차 T 세포. 여기에 제시 된 결과 CD4의 차이 설명+ 와 CD8+ 자동차 T 우리의 이전 게시21의 독립적인 건강 한 기증자 로부터 생성 된 셀. 표준 degranulation 분석 결과 통해 우리 모두 관찰할 수 있었다 CD4+ 와 CD8+ 자동차 T CD107a 및 세포내 cytokine의 식에 의해 표시 된 대로 셀 똑같이 GBM 세포 타겟된 항 원 표현에 대 한 활성화 되었다 (그림 2A). 그러나, 우리는 발견 반복적인 종양 도전 분석 결과 사용 하 여, CD4+ CD8 하지 하지만+ 차 T 세포 전시 다중 라운드 살인 (그림 2B)의 기능. CD4+ 차 T 세포 또한이 분석 결과 (그림 2C) 동안 CD8 + 세포에 비해 더 나은 확장을 달성된. 자동차 T 세포 부분 집합 사이 확장의 차이 관찰 했다 D3에서 종양 도전 (1시 12분 E:T)의 2 라운드 후 종양 도전 (1시 20분 E:T)의 3 라운드 후 d 5에서 시작, 나타내는 세포 독성의 차이가 관찰 하는 동안 단기 분석 실험은 다른 자동차 T 셀 제품의 효능에는 차이 명료 하 게 하지 못했습니다. 때 1:1 혼합 CD4+ 와 CD8+ 차 T 세포는이 분석 결과에 적용 된, 그들은 것을 발견 했다 CD8 능가할+ 하지 CD4 하지만 장기 세포 독성 (그림 2B)에+ 차 T 세포. CD8의 확장+ 차 T 세포 공동 적용된 CD4에 의해 유도 되었다+ 세포, CD4 동안+ 차 T 세포 확장 CD8 존재 저해 했다+ 세포 (그림 2C). CD4 사이 이펙터 활동을 구별 하는 메커니즘을 설명 하기 위해+ 와 CD8+ 차 T 세포, 우리가 먼저 확인 초기 후 그 24 시간 공동 문화, 두 CD4+ 와 CD8+ 차 T 세포 했다 comparably 활성화 (그림 3 A). 한편, CD45RO CD62L 식 두 CD4에 표시 된 대로+ 와 CD8+ 차 T 세포 중앙 메모리에서 전환 했다 (CD45RO+, CD62L+) 이펙터 메모리 (CD45RO+, CD62L-) 표현 형 동안 반복 종양 챌린지 (그림 3B). 우리는이 분석 결과의 d 3에 셀 특징 다음 차 T 세포 부분 집합 기능 차이 표시 하기 시작 하기 전에 한 번. T 세포 소모 억제 수용 체 PD-1, 지연 3과 팀-315,21, 보여주는의 공동 식에 의해 표시 되었다 그 CD8+ 차 T 세포 CD4에 비해 소모 하는 더 경향이 있었다+ 차 T 세포 ( 그림 3 C). 또한, 차이가 CD8에 보였다+ 공동 적용된 CD4의 존재/부재에 차 T 세포 소모+ (그림 3C)을 나타내는 세포는 CD4 유도 CD8+ 자동차 T 셀 확장은 더 나은 effector 기능 연관 된. 함께,이 분석 결과에서 결과 확인 그 CD4+ 차 T 실적된 CD8 세포+ 세포 특히 장기 세포 독성. 유사한 단기 세포 독성 (1-3 일, 한 번 rechallenged) CD4에도 불구 하 고+ 차 T 세포 CD8 동안 반복적인 종양 도전 시 지속적인된 effector 기능+ 세포 소진 되었고 종양 세포의 성장을 제어 하는 데 실패. 두 개의 하위 혼합 했다, CD4+ 차 T 세포 CD8의 확장을 촉진+ 차 T 세포, CD8의 고갈 상태 하지만+ 세포, 두 그룹 간의 시너지 효과의 부족의 결과로 ameliorated 하지 했다. 비슷한 차이 CD4+ 와 CD8+ 차 T 세포 vivo에서 모델에서 앞에서 설명한21으로 보였다. 실제로, CD8+ 차 T 세포 항 원 양성 재발;와 뒤 하지만 단기 종양 클리어런스를 중재할 수 있었다 반면, CD4+ 차 T 세포 치료 결과, 장기 종양 퇴치21, 생체 외에서 rechallenge 분석 결과 사용 하 여 그들의 반복적인 살인 잠재력의 연상입니다. 그림 1 : 반복적인 도전 분석 결과의 스키마 및 분석 전략. (A) 스키마 그리고 타임 라인의 반복 종양 도전 분석 결과. 각 잘 차 T 세포 처음 PBT030-2 GBM 셀 (자동차 + 셀 4000, 16000 종양 세포)와 공동 경작 되었고 다시 32000 종양 세포 (D2, D4, D6) 매일 도전. 종양 세포와 자동차 T 휴대폰 번호 뿐만 아니라 자동차 T 세포 표현 형의 분석은 D1, D3, D5, D7에서 수행 됩니다. (B) 공동 문화를 설정 하기 전에 세포 게이팅 자동차 %T 결정 하는 전략. (C) 게이팅 라이브 세포, 종양 세포와 반복적인 과제 분석 결과에서 차 T 세포의 전략. (D) 종양 세포 rechallenge 분석 결과, untransduced T 세포와 공동 경작의 다른 시간에 번호를. 오차 막대 = ±SEM. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오. 그림 2 : 반복적인 도전 분석 결과 밝혀 CD4 살인 및 증식 효능 차이+ 와 CD8+ 자동차 T 셀. (A) Degranulation와 CD4의 얼룩이 지는 세포내 cytokine+ 와 CD8 GBM 셀 후 공동 문화 5 h+ 차 T 세포 (E:T = 1:1). (B) CD4+, CD8+ 또는 혼합 (CD4:CD8 = 1:1) 차 T 세포 반복적인 도전 분석 결과에 적용 된 및 가능한 종양 세포 계량 했다. p < 0.05 * *p < 0.01, * * *p < 0.001 c d 4와 비교+, Bonferroni의 여러 비교 테스트 편도 ANOVA를 사용 하 여. (C) CD4+ 와 CD8+ 반복 종양 도전 분석 결과 중 차 T 세포 확장. (왼쪽에서 오른쪽)의 비교 CD4+ vs CD8+, 단일 하위 집합; CD4+ vs CD8+, 그룹 내에서 “혼합”; CD4+, 싱글 vs 혼합; CD8+, 싱글 vs 혼합. p < 0.05 * *p < 0.01, * * *p < 0.001 짝이 없는 학생의 t 시험을 사용 하 여. 오차 막대 = ±SEM. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오. 그림 3 : 반복적인 도전 시험 동안 T 세포 표현 형의 분석. (A) 4-1BB와 분석 결과의 d 1에서 자동차 T 세포에 CD69 얼룩. (B) CD45RO 및 CD62L rechallenge (입력), 분석 결과를 적용 하기 전에 그리고 d 3와 D7 분석 결과의 자동차 T 세포의 얼룩. (C) 공동 식 PD-1, 지연 3 및 분석 결과의 D3에서 자동차 T 세포에 팀-3. (맨 위) 1, 2 또는 3 억제 수용 체를 표현 하는 T 세포를 식별 하는 전략 게이팅 (아래) 비교: CD4+ 셀 (단일 하위 집합), CD8+ 셀 (단일 하위 집합), CD8+ (그룹 내에서 “혼합”) 세포. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오. 표 1: rechallenge 설치의 대표적인 접시 지도.

Discussion

이 반복적인 종양 세포 도전 분석 결과 자동차 T 세포 기능 힘, 생체 조건 종양 모델와 관련 된 높은 종양 부담이 생체 외에서 설치를 사용 하 여 평가에 대 한 편리한 접근을 제공 합니다. 두 일 분석 결과 중 차 T 세포 종양 도전 (초기 공동 문화 및 3 x rechallenge)의 4 라운드를 받 다 지쳐 T 세포 강력한 초기 대응에도 불구 하 고 종양도 전에 대응 하는 그들의 기능을 잃을 수 있습니다 환경. 종양 세포 제거 및 자동차 T 셀 확장 대표이 분석 결과에서 취득 될 수 있다 T 세포 활성화를 나타내는 표면 또는 세포내 마커 얼룩에 의해 자동차 T 세포의 고기를 쉽게 분석할 수 있는 동안 두 기본 정보 피로 또는 메모리입니다. 이 분석 결과 또한 바이어스 비 분석 자동차 T 세포 transcriptome, 프로테옴 또는 형광체 프로테옴21,26및 임상 응답27을 예측 하기 위해 채택 된 T 세포 polyfunctionality와 결합 하 여 편리 하다. 또한, 종양 세포 cytokine 분 비28같은 T 세포 면역에 대 한 그들의 적응 응답도 테스트할 수 있습니다. 예제는 여러 시간 지점에서 수확 하 고, 이후이 분석 결과 수 있습니다 정적, 뿐만 아니라 자동차 T 셀 동작의 동적 분석에 대 한 종양 세포의 과잉 수 응답.

분석 결과 비교 이펙터 힘 차 T 세포 같은 항을 대상으로 하지만 다른 디자인 및 제조 공정에 특히 강력 하다. 우리는 CD4 식별 하이 분석 결과 사용+ 차 T 세포 CD8 보다 우수한 장기 effector 기능을 중재할 수 있었다+ 세포21. 그것은 또한 그 vivo에서 차 효능 더 생체 외에서 자동차 T 셀 평가 대 한 반복적인 종양 도전 사용의 필요성을 강조,이 분석 결과 중 나중 시간 포인트 (D5-D7)에서 세포 독성을 연관 했다 표시 했다. GBM 셀은 대상 셀 여기의 예제로 사용 했다,이 분석 결과 다른 T 세포 종양 조합에 쉽게 채택 될 수 있었다. 특히, 자동차 T 셀 동작 또한 다른 항 원 밀도 및 엔지니어링 암 세포 타겟된 항 차 인식29시 순차 분자 이벤트를 조사 하는 도구를 제공의 다양 한 레벨을 표현 하 게 달라질 수 있습니다. 따라서,이 분석 결과 다른 대상에 대 한 특정 차 T 세포의 활성화 패턴을 검사 하 또한 악용 될 수 있습니다.

대상 세포 생존 능력 및 자동차 T 셀 확장이 분석이 결과의 두 가지 선행 정보 때문에, 그것은 중요 한 모든 공동 문화 가능한로 시작 (> 70%) 종양 그리고 T 세포입니다. Rechallenge 프로세스를 수행할 때 종양과 T 셀 셀의 불필요 한 변이 소개 하기 위하여 우물의 바닥에 있는 발음 미디어 (5.3 단계)의 작업 방해 한다. 정지 대상 셀 라인에서이 분석 결과 수행할 때 종양 세포 rechallenge 전에 원심 분리 하 여 남아 있는 세포를 수확 하 좋습니다.

이 분석 결과의 한 가지 한계는 설치 매개 변수 (초기 공동 문화 및 rechallenge E:T 비율) 해야 한다는 조정 될 다른 자동차 종양 조합에 따라. 예를 들어 종양 세포 면역 억제 분자 (예: PD-L1)의 상당한 수준, 표현 하는 경우 더 높은 E:T 비율 권장 주어진 전체 효율을 죽이 장애인 PD-L1-낮은 종양 세포와 비교. 새로운 자동차-종양 조합에 분석 결과 적용 하기 전에 파일럿 연구 것이 좋습니다 최적의 조건을 결정 하는 일반적으로 제거를 분석 결과에서 테스트 하는 가장 강력한 자동차 T 세포 수 > 끝점에서 종양 세포의 80%. 종양 세포 형광 표시 된 경우 직접 셀 접촉 자동차 살해 T 세포 중재를 위해 필요 하다, 이후 다음 흐름 cytometric 분석의 패널을 조정 해야 따라 (예: 종양 세포 GFP 표시, 다음 어떤 FITC 활용 된 경우 항 체 해야 사용할 수 없습니다).

자동차 T 세포 B 세포 악성 종양에 대 한의 임상 활동 두 FDA의 승인을 마약을 주도하 고 있다. 그러나, 응답 다른 환자27,,3031, 자동차 제품30의 phenotypic 속성와 상관 관계를 해명 했다에서 상당한 변화를 보이고 있다. 이 생체 외에서 반복적인 종양 도전 분석 결과 추가 phenotypic characterizations 및 polyfunctionality cytokine 생산, 자동차 이펙터 힘 기능 테스트에 대 한 접근을 제공 하 고의 높은 처리량 검열에 대 한 있습니다. 예측 정확도 유지 하면서 생체 조건 종양 모델에 비해 임상 제품. 전반적으로,이 분석 결과 자동차 T 셀 디자인, 전 임상 및 임상 개발에 대 한 T 세포 기능 테스트 사용 될 수 있습니다.

Offenlegungen

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

이 작품은 캘리포니아 연구소의 재생 의학 (CIRM) 부여 TR3 05641 및 NIH 교부 P30 CA33572 (코어)에서 교부 금에 의해 지원 되었다. D.W.는 NCI 친목 1F99CA234923-01에 의해 지원 됩니다.

Materials

0.05% Trypsin/0.53mM EDTA in HBSS w/o Calcium and Magnesium Corning MT25051CI
1M Hepes Irvine Scientific 9319
200 mM L-Glutamine Cambrex Bio Science 17-605E
4',6-diamidino-2-phenylindole, dihydrochloride (DAPI) – FluoroPure grade Invitrogen D21490
Accutase Innovative Cell Technologies AT104
Aldesleukin Proleukin (rhIL-2) Novartis Oncology NDC 0078-0495-61
Anti-CD137, PE BD Biosciences 555956 4B4-1
Anti-CD19, PE-Cy7 BD Biosciences 557835 SJ25C1
Anti-CD3, PERCP BD Biosciences 340663 SK7
Anti-CD4, FITC BD Biosciences 340133 SK3
Anti-CD45, PERCP BD Biosciences 340665 2D1
Anti-CD45RO, PE BD Biosciences 561137 UCHL1
Anti-CD62L, APC BD Biosciences 559772 DREG-56
Anti-CD69, APC BD Biosciences 340560 L78
Anti-CD8, APC-Cy7 BD Biosciences 348793 SK1
Anti-IL-13, PE BD Biosciences 340508 JES10-5A2
Anti-LAG-3, PE eBiosciences 12-2239-41 3DS223H
Anti-PD-1, APC-Cy7 BioLegend 329921 EH12.2H7
Anti-TIM-3, APC eBiosciences 17-3109-42 F38-2E2
B-27 Serum-Free Supplement (50X) Invitrogen 17504-044
Corning 96 Well Clear Flat Bottom Polystyrene TC-Treated Microplates, Individually Wrapped, with Lid, Sterile (Product #3596) Corning Life Sciences 3596
Defined fetal bovine serum,HI IR Hyclone Labs SH30070.03IH
DMEM F-12 50:50 (1X) w/o Glutamine MediaTech, Inc. 15-090-CV
DMEM High Gluc w/o L-Glu, Na Pyr 1 L Invitrogen 11960051
DMEM-Ham's F12 50:50 Mixture with L-glutamine and 15 mM HEPES Fisher Scientific MT10092CV
HBSS Irvine Scientific 9224
Heat-Inactivated FCS Hyclone SH30070.03
Heparin Sodium(1,000 U/ml) American Pharmaceutical 401811B
MACSQuant Milteni Biotech Inc. BIS013220 
PBS 1X W/CA & MG Irvine Scientific 9236
PBS with 1MM EDTA (No Ca2+ or Mg2+) VWR Scientific Products PB15009A
Recombinant human EGF R&D Systems 236-EG-200
Recombinant human FGF R&D Systems 233-FB
rhIL-15 Working Dilution (10 ng/µL) CellGenix, US Operations tF0297
Sodium Azide (NaN3) Sigma S8032
Sorvall ST40R Thermo Scientific 41693700
TC-HEPES BUFFER (1M) SOLN 100ML  IRVINE SCIENTIFIC CORP 6472
Tecnol Procedure Mask Kimberly-Clark 47117
X-VIVO 15 Lonza BW04-744Q
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Referenzen

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In VitroTumor CellRechallengeChimeric Antigen ReceptorCAR T CellsAnti-tumor FunctionGlioblastomaTumorspheresCo-cultureHigh Throughput ScreeningCell DissociationCell SuspensionCell CultureSupernatantTrypsin EDTA

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Wang, D., Starr, R., Alizadeh, D., Yang, X., Forman, S. J., Brown, C. E. In Vitro Tumor Cell Rechallenge For Predictive Evaluation of Chimeric Antigen Receptor T Cell Antitumor Function. J. Vis. Exp. (144), e59275, doi:10.3791/59275 (2019).
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