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Krebsforschung

In Vitro del tumore delle cellule Rechallenge per valutazione predittiva della funzione antitumorale chimerico antigene recettore delle cellule T

Published: February 27, 2019
doi:
10.3791/59275
, , , , ,
1Department of Hematology & Hematopoietic Cell Transplantation, T Cell Therapeutics Research Laboratory,City of Hope Beckman Research Institute and Medical Center, 2Irell and Manella Graduate School of Biological Sciences,City of Hope Beckman Research Institute and Medical Center

Summary

Qui, descriviamo un metodo di co-coltura in vitro di cellule di T del tumore targeting sfida in modo ricorsivo, che consente analisi fenotipica e funzionale di attività antitumorale delle cellule T.

Abstract

Il campo della terapia delle cellule T di chimerico antigene recettore (auto) sta avanzando rapidamente con miglioramenti in CAR design, approcci di ingegneria genetica e le ottimizzazioni di produzione. Una sfida per questi sforzi di sviluppo, tuttavia, è stata l’istituzione di analisi in vitro che può informare robustamente selezione dei prodotti delle cellule T auto ottimali per il successo terapeutico in vivo. Dosaggi standard lisi del tumore in vitro spesso non riescono a riflettere il vero potenziale antitumorale delle cellule di T di auto a causa del tempo relativamente breve co-coltura e alta delle cellule di T al rapporto del tumore. Qui, descriviamo un metodo di co-coltura in vitro per valutare auto T cellulare ricorsiva uccidendo potenziale alto tumore delle cellule carichi. A questo dosaggio, la funzione citotossica a lungo termine e la capacità proliferativa delle cellule di T auto viene esaminati in vitro oltre i 7 giorni con tumore ulteriori obiettivi amministrati alla co-cultura ogni altro giorno. Questo test può essere abbinato a profilatura l’attivazione delle cellule T, esaurimento e fenotipi di memoria. Usando questa analisi, abbiamo distinto con successo le differenze fenotipiche e funzionali tra CD4+ e CD8+ auto T cells contro il glioblastoma (GBM), riflettendo la loro attività antitumorale in vivo differenziale in orthotopic modelli di xenotrapianto. Questo metodo fornisce un facile approccio per valutare la potenza delle cellule di T di auto e per delucidare le variazioni funzionali attraverso diversi prodotti delle cellule di T auto.

Introduction

Immunoterapia con recettore chimerico antigene (auto)-cellule T ingegnerizzate ha visto risultati promettenti contro B cellula malignità1,2,3,4, mentre il potenziale di targeting per altri tumori continua ad essere sotto indagine rigorosa5,6,7. Grandi progressi per ottimizzare il costrutto auto, il processo di fabbricazione e il paziente pre-infusione regimi6,7,8, e approcci di biologia sintetica romanzo si pensano che aumentino loro persistenza, sicurezza e tumore specificità9,10. Tuttavia, è stato difficile e laborioso per valutare in modo appropriato il potenziale terapeutico delle cellule di T auto al fine di orientare la scelta migliore per traduzione clinica. Il modello più affermato finora per valutare la funzione delle cellule di T auto è in topi immunodeficienti che sopportano gli xenotrapianti del tumore umano, per cui le cellule T auto sono esaminate per efficacia antitumorale e rispetto alle cellule titolato dosi11,12 , 13 , 14 , 15. questi studi in vivo murini sono laborioso e che richiede tempo, soprattutto quando un numero elevato di parametri di screening. Ulteriori studi in vivo possono essere trattenuti dall’accessibilità di diversi ceppi di topi, tecniche di gestione degli animali e servizi di cura degli animali. Di conseguenza, c’è la necessità di sviluppare le analisi in vitro più conveniente consentendo rapide letture di attività dell’effettore, che rispecchiano anche la funzione antitumorale in vivo di queste cellule di T.

I metodi convenzionali per determinare la citotossicità delle cellule T in vitro si sono concentrati sull’individuazione di degranulazione, produzione di citochine e la capacità di lisare cellule bersaglio con etichetta del radioisotopo (i.e., saggi di rilascio di cromo). Mentre queste analisi sono informative per definire la specificità delle cellule di T auto e riconoscimento di destinazione reindirizzata, riescono spesso a riflettere il potenziale antitumorale in vivo di derivati dal T cellule12,13,16. In alcuni casi, in vitro uccidendo attività nelle analisi a breve termine hanno mostrato una correlazione inversa con funzione antitumorale in vivo16. Tale incoerenza è probabilmente il risultato di rapporti dell’effettore: target alto (E:T) utilizzato in questi saggi in vitro e quindi l’incapacità di differenziare i prodotti delle cellule T auto che sono inclini a esaurimento17. Al contrario, durante l’estirpazione del tumore in vivo T cellule rispondono solitamente contro gli oneri di grande tumore, quindi che richiedono più cicli di abbattimento e successivamente guida cellula T differenziazione ed esaurimento18,19, 20, che è uno dei principali ostacoli contro lo spazio di efficace del tumore da auto T cellule12,13. Nel frattempo, analisi di uccisione in vitro più a breve termine anche fanno non le differenze di lettura nella proliferazione delle cellule T, mentre in auto T cellulare trattati pazienti la capacità di espansione di cellule T auto è fortemente correlata con le risposte cliniche4. Così, l’analisi in vitro appropriato avrebbe bisogno di ricapitolare le condizioni di carico elevato del tumore, induzione di cellule T esaurimento e consente la lettura dell’espansione delle cellule T.

Qui descriviamo una strategia per valutare le cellule di T auto per uccisione potenziale, con un saggio di semplice co-coltura in vitro del tumore ripetitivo. Parametri di attività differenti delle cellule T effettrici possono essere esaminati simultaneamente, tra cui uccisione delle cellule bersaglio, espansione di cellule T auto e fenotipi associati di memoria o esaurimento. I risultati generati da questo test correlano bene con l’effetto antitumorale in vivo delle cellule di T di auto e possono essere sfruttati per valutare la potenza dei prodotti delle cellule di T di auto. Mentre Descriviamo un test per valutare le cellule di T di auto IL13Ra2-mirati contro primario GBM linee21, può essere facilmente adattato a qualsiasi piattaforma di cellula T auto.

Protocol

Nostri IRB non richiede la modifica del presente protocollo. Riceviamo campioni tumorali di glioblastoma fresco scartati dalla città della speranza dipartimento patologie che sono codificate, e il nostro laboratorio non può accedere alla chiave. Riceviamo i campioni con dati solo su preventiva dello stato di malattia e trattamento al momento della biopsia/resezione, con nessun dati identificativi. 1. Media preparazione Preparare il supporto di cellule staminali neurali per la coltura di linee di cellule GBM primarie: DMEM:F12, 01:50 B27, 5 µ g/mL eparina e 2 mmol/L L-Glutammina; completati con 20 ng/mL fattore crescita epidermico (EGF) e 20 ng/mL basic fibroblast growth factor (FGF) due volte a settimana (Vedi Tabella materiali). Preparare il supporto di cellula T: 15 X-VIVO contenente 10% di siero fetale di vitello (FCS); completati con 70 IU/mL rhIL-2 e 0,5 ng/mL rhIL-15 ogni 48 ore (Vedi Tabella materiali). Preparare il supporto di co-coltura: prendere delle cellule staminali neurali media senza supplemento EGF e FGF e aggiungere 10% FCS. Preparare FACS macchiatura soluzione (FSS): HBSS, 2% FCS, NaN3 (0,5 g/500 mL). 2. preparazione delle cellule del tumore GBM Raccogliere sfere di basso-passaggio GBM tumore (TSs) mediante centrifugazione a 300 x g per 4 minuti ed eliminare il surnatante.Nota: Tumore GBM sfere (TSs) vengono generati da resecato tumori come descritto in precedenza22,23,24e mantenuto in media delle cellule staminali neurali, in incubatrice con 5% CO2 a 37 ° C. Preriscaldare la co-coltura in bagnomaria a 37 ° C. Aggiungere 1 mL di freddo accutase a GBM TSs, dissociare TSs pipettando per 30-60 s e fermare la dissociazione aggiungendo 5 mL di caldo di co-coltura.Nota: GBM TSs non dovrebbero essere tenuti su accutase per più di 5 min. Raccogliere le cellule GBM mediante centrifugazione a 300 x g per 4 minuti, eliminare il surnatante e risospendere le cellule in 2 mL di co-coltura. Determinare la concentrazione cellulare mediante un contatore di attuabilità delle cellule.Nota: Attuabilità delle cellule deve essere > 70%. 3. preparazione delle cellule di T di auto Meno di 24 ore prima del saggio, prendere 100 µ l di cellule T auto coltivate in un tubo di citometria a flusso e aggiungere 2 mL di FSS.Nota: Cellule T auto sono state generate come descritto in precedenza11,21 e coltivate in media delle cellule T. Centrifugazione a 300 x g per 4 min e scartare surnatante. Aggiungere 2 mL di FSS per lavare le cellule, centrifugare a 300 x g per 4 min ed eliminare il surnatante. Macchia le cellule con l’anticorpo appropriato per indicare l’espressione di auto a 4 ° C per 30 min.Nota: Ad esempio, se un’auto IL13Rα2-mirati descritto precedentemente25 è utilizzato, quindi macchia con l’anticorpo anti-IL13. Lavare due volte con 2 mL di FSS e analizzare exn auto utilizzando un citometro a flusso. Determinare la % di auto sulle cellule T utilizzando la strategia di gating illustrata nella Figura 1B. Al giorno di co-coltura, raccogliere tutte le auto T cellule mediante centrifugazione a 300 x g per 4 minuti, eliminare il surnatante e risospendere le cellule in 2 mL di co-coltura. Determinare la concentrazione cellulare mediante un contatore di attuabilità delle cellule.Nota: Attuabilità delle cellule deve essere > 70%. 4. messa a punto del tumore — co-coltura delle cellule T Diluire le cellule del tumore per una concentrazione di 0,16 milioni/mL con mezzi di co-coltura. Basato su auto %, diluire le cellule di T auto a una concentrazione di cellule/mL di 0,04 milioni auto+ con mezzi di co-coltura.Nota: Ad esempio, se l’auto è del 50% e la concentrazione delle cellule T è 0,4 milioni/mL, quindi fare una diluizione 1:5 per ottenere la concentrazione finale di 0,04 milioni auto+ cellule/mL. Pipettare 100 µ l di cellule del tumore diluito in ciascun pozzetto di una piastra di coltura del tessuto 96 pozzetti a fondo piatto. Pipettare 100 µ l di cellule di T di auto diluite in ciascun pozzetto che contiene ben mix e le cellule del tumore.Nota: Ogni co-coltura delle cellule di tumore-T sarà analizzato a 4 punti di tempo. 4-6 ripetizioni potrebbero essere richiesti a ogni volta punto basato su analisi diverse, ma < 3 ripetizioni per punto nel tempo non è consigliato; vedere la tabella 1 per un rappresentante platemap. Mantenere la piastra in un 37 ° C, 5% CO2 incubator. 5. tumore delle cellule Rechallenge Nota: Rechallenge avviene a 2, 4 e 6 giorni dopo l’installazione iniziale di co-coltura (Figura 1A). Raccolto e dissociare GBM TSs come descritto sopra (punti 2.1-2.6). Risospendere le cellule GBM ad una concentrazione di 0,64 milioni/mL. Determinare i pozzi di co-coltura che bisogno rechallenge (Vedi tabella 1) e rimuovere con cura 50 µ l supporto dalla parte superiore di ciascun pozzetto. Aggiungere 50 µ l della sospensione di cellule GBM in ciascun pozzetto e mescolare bene, quindi rimettere la piastra a 37 ° C, 5% CO2 incubator. 6. raccogliere campioni e analisi Cytometric di flusso Nota: I campioni saranno raccolti a 1, 3, 5 e 7 giorni dopo che l’installazione iniziale di co-coltura, con 1, 2, 3 e 4 giri di sfida del tumore, rispettivamente. Soluzione di tripsina-EDTA 0,05% pre-riscaldare a bagnomaria a 37 ° C. Determinare i pozzi che bisogno di raccogliere e trasferire i media in una piastra a 96 pozzetti turno-fondo nuova. Pipettare 50 µ l di tripsina-EDTA nei pozzetti per digerire le cellule del tumore rimanente a 37 ° C per 5 min. Sotto un microscopio, confermare che le cellule sono staccate dal fondo. Pipettare intorno alla parte inferiore ben per risospendere le cellule indipendente, quindi trasferire la tripsina-EDTA contenente cellule indipendente ai rispettivi pozzetti della piastra 96 pozzetti turno-inferiore. Centrifuga della piastra a 96 pozzetti turno-inferiore a 300 x g, 4 ° C per 4 min, poi gettare il surnatante. Aggiungere 200 µ l/pozzetto di FSS per lavare le cellule, centrifugare a 300 x g, 4 ° C per 4 minuti, quindi eliminare il surnatante. Risospendere le cellule in 100 µ l/pozzetto FSS che contiene gli anticorpi (Vedi Tabella materiali) e macchia cellule a 4 ° C per 30 min. Aggiungere 100 µ l/pozzetto FSS alle celle, centrifugare a 300 x g, 4 ° C per 4 min, poi scartare surnatante. Aggiungere 200 µ l/pozzetto di FSS per lavare le cellule, centrifugare a 300 x g, 4 ° C per 4 minuti, quindi eliminare il surnatante. Risospendere le cellule con 100-200 µ l/pozzetto di FSS con 500 ng/mL DAPI, quindi analizzare campioni tramite flusso cytometry. 7. funzionale e Phen Otypic analisi delle cellule di T di auto Recuperare i file di dati da citometro a flusso e cancello tutte le cellule vive (DAPI-) (Figura 1C). Quantificare le cellule del tumore di gating il CD45 popolazione– e cellule di T auto di gating il CD45+, + automobile popolazione (Figura 1C).Nota: Se le cellule tumorali esprimono CD45 (ad es. cellule di linfoma Raji), anti-CD3 macchiatura può essere utilizzata per differenziare le cellule di T dalle cellule del tumore. Trama delle cellule del tumore e il numero delle cellule di T di auto attraverso il corso di tempo. Identificare l’attivazione delle cellule T di co-espressione di 4-1BB e CD69.Nota: Questi marcatori di superficie possono essere utilizzati per analizzare co-coltura del 6-24 h post di cellula T l’attivazione iniziale. Identificare cellule T esaurimento dall’espressione di PD-1, Gal-3 e TIM-3. Identificare lo stato delle cellule T memoria dall’espressione di CD45RO e CD62L.

Representative Results

Usando l’analisi sopra descritta, abbiamo distinto la potenza differenziale effettrici e uccidendo dinamica mediata da CD4+ e CD8+ auto T cellule. I risultati presentati qui illustrano la differenza tra CD4+ e CD8+ auto T cellule, generate da un donatore sano indipendente della nostra precedente pubblicazione21. Attraverso un test di degranulazione standard, siamo stati in grado di osservare che entrambi CD4+ e CD8+ auto T cellule è diventato ugualmente attivati contro le cellule GBM che esprimono l’antigene mirato, come indicato dall’espressione di CD107a e intracellulari di cytokine (Figura 2A). Tuttavia, usando l’analisi di sfida di tumore ripetitivo, abbiamo trovato che CD4+ ma non CD8+ auto T cellule hanno esibito la capacità dell’uccisione multipla-turno (Figura 2B). CD4+ auto T cellule anche raggiunto espansione migliore rispetto alle cellule CD8 + durante questo test (Figura 2C). La differenza di dilatazione tra sottoinsiemi a cellula T di auto sono stati osservati soltanto da D3 dopo due turni di sfida del tumore (1:12 t), mentre la differenza di citotossicità è stata osservata cominciando a D5 dopo tre turni di sfida del tumore (1:20 E:T), che indica che analisi a breve termine non è riuscito a chiarire le differenze nella potenza dei diversi prodotti delle cellule di T auto. Quando il 1:1 misto CD4+ e CD8+ auto T le cellule sono state applicate a questo test, sono stati trovati a sovraperformare CD8+ ma non CD4+ auto T cellule su citotossicità a lungo termine (Figura 2B). L’espansione di CD8+ auto T cellule è stata indotta tramite il co-applicata CD4 cellule+ , mentre CD4+ espansione di cellule T auto è stata inibita in presenza di CD8+ cellule (Figura 2C). Per spiegare il meccanismo che contraddistingue l’attività dell’effettore tra CD4+ e CD8+ auto T cellule, confermiamo innanzitutto che 24 h dopo la co-cultura, entrambi CD4+ e CD8+ auto T cellule erano attivati in modo paragonabile (Figura 3 A). Nel frattempo, come indicato dall’espressione CD45RO e CD62L, entrambi CD4+ e CD8+ auto T cellule hanno mostrato una transizione dalla memoria centrale (CD45RO+, CD62L+) alla memoria dell’effettore (CD45RO+, CD62L–) fenotipo durante la sfida di tumore ripetitivo (Figura 3B). Poi abbiamo caratterizzato le cellule a D3 di questo test, un tempo prima che i sottoinsiemi a cellula T di auto ha iniziato a visualizzare la differenza funzionale. Esaurimento delle cellule t è stato caratterizzato dal co-espressione di recettori inibitori PD-1, Gal-3 e TIM-315,21, che ha mostrato quella CD8+ auto T cellule erano più inclini ad esaurimento rispetto con CD4+ auto T cellule ( Figura 3 C). Inoltre, si è osservata nessuna differenza il CD8+ esaurimento di cellula T auto in presenza/assenza di co-applicata CD4+ cellule (Figura 3C), che indica quella indotta da CD4 CD8+ espansione di cellule T auto non è associato a una migliore funzione effettrice. Insieme, i risultati di questa analisi identificato quel CD4+ auto T cellule CD8 ha superato+ cellule specificamente nella citotossicità a lungo termine. Nonostante la citotossicità simile a breve termine (1-3 giorni, una volta rechallenged), CD4+ auto T cellule effettrici sostenuta funzione su sfida ripetitivo del tumore, mentre CD8+ cellule è diventato esaurite e non è riuscite a controllare la crescita delle cellule tumorali. Quando i due sottoinsiemi sono stati mescolati, CD4+ auto T cellule ha facilitato l’espansione di CD8+ auto T cellule, ma lo stato di esaurimento di CD8+ le cellule non sono state migliorate, con conseguente mancanza di effetto sinergico fra i due gruppi. Simile differenza tra CD4+ e CD8+ auto T cellule è stata veduta in un modello in vivo come descritto in precedenza21. Infatti, CD8+ auto T cellule erano in grado di mediare lo spazio ma seguita a breve termine-del tumore con la ricorrenza dell’antigene-positivo; in contrasto, CD4+ trattamento di cellule di T di auto ha provocato a lungo termine del tumore eradicazione21, che è rievocativo del loro potenziale di uccisione ripetitivo usando l’analisi in vitro rechallenge. Figura 1 : Strategia di analisi e schema di dosaggio ripetitivo sfida. Schema (A) e sequenza temporale di analisi di sfida del tumore ripetitivo. Per ciascun pozzetto, cellule di T di auto sono stati co-coltivate con cellule di GBM PBT030-2 (4.000 auto + cellule, 16.000 cellule del tumore) e risfidate con 32.000 cellule tumorali ogni altro giorno (D2, D4 e D6). Analisi della cellula tumorale e numero di cellule T auto, nonché a fenotipo delle cellule di T auto avviene a D1, D3, D5 e D7. (B) Gating strategia per determinare la % di auto in T cellule prima di impostare la co-cultura. (C) strategia di cellule vive, le cellule del tumore e le cellule di T auto del dosaggio ripetitivo sfida di Gating. Numero di cellule di (D) del tumore in momenti diversi del test rechallenge, co-coltivate con le cellule di T untransduced. Barre di errore = valori. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura. Figura 2 : Sfida ripetitivo analisi rivela differenze nella potenza di uccisione e proliferativa tra CD4+ e CD8+ auto T cellule. (A) degranulazione e intracellulari di cytokine colorazione dei CD4+ e CD8+ auto T cellule dopo 5 h di co-coltura con cellule di GBM (t = 1:1). (B) CD4+, CD8+ o misto (CD4:CD8 = 1:1) le cellule di T di auto sono state applicate a dosaggio ripetitivo sfida, e cellule tumorali vitali sono state quantificate. p < 0,05, * *p < 0.01, * * *p < 0.001 confrontato con CD4+, usando il One-way ANOVA con più test di confronto di Bonferroni. CD4 (C)+ e CD8+ espansione di cellule T auto durante l’analisi di sfida del tumore ripetitivo. Confronto di (da sinistra a destra) CD4+ vs CD8+, singolo sottoinsieme; CD4+ vs CD8+, all’interno del gruppo “misto”; CD4+, singolo vs miscelati; CD8+, singolo vs miscelati. p < 0,05, * *p < 0.01, * * *p < 0,001 utilizzando il test t di Student un spaiati. Barre di errore = valori. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura. Figura 3 : Analisi del fenotipo delle cellule di T durante il dosaggio ripetitivo sfida. (A) 4-1BB e CD69 colorazione sulle cellule di T auto a D1 del dosaggio. (B) CD45RO e CD62L macchiatura delle cellule di T auto prima di applicare per risfidare test (ingresso) e a D3 e D7 del dosaggio. (C) co-espressione di PD-1, Gal-3 e TIM-3 sulle cellule di T auto a D3 del dosaggio. (In alto) Gating strategie per identificare le cellule di T che esprimono recettori inibitori 1, 2 o 3. (In basso) Confronto tra: CD4+ cellule (singolo sottoinsieme), CD8+ cellule (singolo sottoinsieme), CD8+ cellule (all’interno del gruppo “misto”). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura. Tabella 1: Mappa rappresentante piastra di installazione rechallenge.

Discussion

Questa analisi di sfida delle cellule di tumore ripetitivo fornisce un approccio conveniente per valutare la potenza funzionale delle cellule di T auto, che utilizza un’installazione in vitro che ricapitola l’onere di alto tumore connesso con modelli in vivo del tumore. Durante questo test di 7 giorni, le cellule T auto subiscono quattro giri di sfida del tumore (co-coltura iniziale e rechallenge x 3), creando un ambiente dove esausto T cellule potrebbero perdere la loro capacità di rispondere alla sfida del tumore malgrado una potente risposta iniziale. Eliminare le cellule del tumore e l’espansione di cellule T auto rappresentano due letture fondamentali che possono essere acquisite da questo test, mentre i fenotipi delle cellule di T di auto possono essere facilmente analizzati dalla macchiatura marcatori di superficie o intracellulari che indicano l’attivazione delle cellule T, esaurimento e/o memoria. Questo test è anche conveniente combinare con imparziale analisi del trascrittoma di cellule T auto, proteoma o fosforo-proteoma21,26e polifunzionalità delle cellule T, che è stato adottato per predire le risposte cliniche27. Inoltre, le cellule del tumore possono essere testate anche per loro risposta adattativa contro l’immunità delle cellule T come citochina secrezione28. Dal momento che i campioni sono raccolti a più punti di tempo, questa analisi consente non solo statica, ma anche analisi dinamica del comportamento delle cellule di T auto quando si risponde a un numero in eccesso delle cellule del tumore.

Il dosaggio è particolarmente potente in confronto la potenza dell’effettore delle cellule di T auto targeting per lo stesso antigene, ma con differenti disegni e/o processi di fabbricazione. Abbiamo usato questo test per identificare quel CD4+ auto T cellule erano in grado di mediare funzioni effettrici a lungo termine superiori di CD8+ cellule21. Inoltre è stato indicato che in vivo l’efficacia di auto è stato correlato con la citotossicità in momenti successivi (D5-D7) durante questo test, evidenziando ulteriormente la necessità di utilizzare sfida tumore ripetitivo per valutazione in vitro di cellule T auto. Anche se le cellule GBM sono state utilizzate come nell’esempio delle cellule bersaglio qui, questo test potrebbe essere facilmente adottato ad una combinazione di diverse cellule T-tumore. In particolare, comportamento delle cellule di T auto possa variare anche a seconda densità differenti dell’antigene e cellule tumorali ingegneria per esprimere vari livelli di antigeni designati forniti lo strumento per studiare gli eventi molecolari sequenziali su auto riconoscimento29. Pertanto, questo test può essere sfruttato anche per esaminare il pattern di attivazione di determinate cellule di T auto contro bersagli diversi.

Poiché l’attuabilità delle cellule bersaglio e l’espansione di cellule T auto sono due letture iniziali di questo test, è fondamentale che tutte le co-culture iniziano con vitali (> 70%) tumore e cellule T. Quando si esegue i processi di rechallenge, l’azione di aspirazione media (punto 5.3) non dovrebbe disturbare tumore e le cellule T nel fondo dei pozzetti, in modo da non introdurre inutili variazioni della conta delle cellule. Quando si esegue questo test su linee cellulari di sospensione destinazione, è consigliabile raccogliere le cellule rimanenti mediante centrifugazione prima rechallenge delle cellule del tumore.

Una limitazione di questo test è che i parametri di configurazione (E:T rapporti di co-coltura iniziale e rechallenge) regolare deve essere basata su diverse combinazioni di auto-tumore. Ad esempio, se le cellule tumorali esprimono un notevole livello di molecole immuno-inibitori (es. PD-L1), un più alto rapporto di E:T è raccomandato dato che la totale efficienza di abbattimento è alterata rispetto alle cellule di tumore del PD-L1-basso. Prima di applicare l’analisi di nuove combinazioni di auto-tumore, uno studio pilota è raccomandato per determinare le condizioni ottimali, che solitamente permette che le cellule di T di auto più potente nel test per eliminare > 80% delle cellule del tumore nel punto finale. Poiché contatto diretto cellula-cellula è necessario per l’auto mediata da cellule T uccisione, se le cellule del tumore sono stati etichettati di fluorescenza, quindi il pannello di analisi cytometric di flusso deve essere regolato di conseguenza (per esempio se le cellule del tumore erano GFP-etichettata, quindi ogni anticorpo coniugato FITC anticorpi non dovrebbero essere usati).

L’attività clinica di cellule di T auto contro le malignità delle cellule di B ha portato a due farmaci approvati dalla FDA. Tuttavia, la risposta ha mostrato una variazione sostanziale attraverso diversi pazienti27,30,31, che è stata delucidata per correlare con la proprietà fenotipiche delle auto prodotti30. Questo test di sfida del tumore in vitro ripetitivo ulteriormente fornisce un approccio per funzionalmente testare la potenza del effector di auto oltre alla caratterizzazione fenotipica e la produzione di citochina di polifunzionalità e permette per un throughput più elevato screening di prodotti clinici rispetto ai modelli in vivo del tumore pur mantenendo la fedeltà predittiva. Nel complesso, questa analisi potrebbe essere usata per il test funzionale delle cellule T per la progettazione di auto T cellulare, sviluppo pre-clinico e clinico.

Offenlegungen

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Questo lavoro è stato sostenuto da sovvenzioni al California Institute per la medicina rigenerativa (CIRM) grant TR3-05641 e sovvenzioni NIH P30 CA33572 (Core). D.W. è supportato da NCI fellowship 1F99CA234923-01.

Materials

0.05% Trypsin/0.53mM EDTA in HBSS w/o Calcium and Magnesium Corning MT25051CI
1M Hepes Irvine Scientific 9319
200 mM L-Glutamine Cambrex Bio Science 17-605E
4',6-diamidino-2-phenylindole, dihydrochloride (DAPI) – FluoroPure grade Invitrogen D21490
Accutase Innovative Cell Technologies AT104
Aldesleukin Proleukin (rhIL-2) Novartis Oncology NDC 0078-0495-61
Anti-CD137, PE BD Biosciences 555956 4B4-1
Anti-CD19, PE-Cy7 BD Biosciences 557835 SJ25C1
Anti-CD3, PERCP BD Biosciences 340663 SK7
Anti-CD4, FITC BD Biosciences 340133 SK3
Anti-CD45, PERCP BD Biosciences 340665 2D1
Anti-CD45RO, PE BD Biosciences 561137 UCHL1
Anti-CD62L, APC BD Biosciences 559772 DREG-56
Anti-CD69, APC BD Biosciences 340560 L78
Anti-CD8, APC-Cy7 BD Biosciences 348793 SK1
Anti-IL-13, PE BD Biosciences 340508 JES10-5A2
Anti-LAG-3, PE eBiosciences 12-2239-41 3DS223H
Anti-PD-1, APC-Cy7 BioLegend 329921 EH12.2H7
Anti-TIM-3, APC eBiosciences 17-3109-42 F38-2E2
B-27 Serum-Free Supplement (50X) Invitrogen 17504-044
Corning 96 Well Clear Flat Bottom Polystyrene TC-Treated Microplates, Individually Wrapped, with Lid, Sterile (Product #3596) Corning Life Sciences 3596
Defined fetal bovine serum,HI IR Hyclone Labs SH30070.03IH
DMEM F-12 50:50 (1X) w/o Glutamine MediaTech, Inc. 15-090-CV
DMEM High Gluc w/o L-Glu, Na Pyr 1 L Invitrogen 11960051
DMEM-Ham's F12 50:50 Mixture with L-glutamine and 15 mM HEPES Fisher Scientific MT10092CV
HBSS Irvine Scientific 9224
Heat-Inactivated FCS Hyclone SH30070.03
Heparin Sodium(1,000 U/ml) American Pharmaceutical 401811B
MACSQuant Milteni Biotech Inc. BIS013220 
PBS 1X W/CA & MG Irvine Scientific 9236
PBS with 1MM EDTA (No Ca2+ or Mg2+) VWR Scientific Products PB15009A
Recombinant human EGF R&D Systems 236-EG-200
Recombinant human FGF R&D Systems 233-FB
rhIL-15 Working Dilution (10 ng/µL) CellGenix, US Operations tF0297
Sodium Azide (NaN3) Sigma S8032
Sorvall ST40R Thermo Scientific 41693700
TC-HEPES BUFFER (1M) SOLN 100ML  IRVINE SCIENTIFIC CORP 6472
Tecnol Procedure Mask Kimberly-Clark 47117
X-VIVO 15 Lonza BW04-744Q
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Referenzen

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Wang, D., Starr, R., Alizadeh, D., Yang, X., Forman, S. J., Brown, C. E. In Vitro Tumor Cell Rechallenge For Predictive Evaluation of Chimeric Antigen Receptor T Cell Antitumor Function. J. Vis. Exp. (144), e59275, doi:10.3791/59275 (2019).
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